利用間充質(zhì)干細(xì)胞的肺動(dòng)脈高血壓的治療的制作方法
【專利說明】
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的奪叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求2012年8月1日遞交的第61/678, 207號(hào)的美國臨時(shí)申請(qǐng)和2013年 1月9日遞交的第61/750, 458號(hào)的美國臨時(shí)申請(qǐng)的權(quán)益，其內(nèi)容通過全文引用方式并入文 中。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本申請(qǐng)涉及間充質(zhì)干細(xì)胞在治療血管病變中的用途，該血管病變包括肺動(dòng)脈高血 壓（PAH)和其它類型的肺高血壓、外周血管疾?。≒VD)、嚴(yán)重肢體缺血（CLI)、冠狀動(dòng)脈疾 病、糖尿病性血管病變等。
【背景技術(shù)】
[0004] 肺動(dòng)脈高血壓是一種漸進(jìn)性肺部疾病，其在被確診后不進(jìn)行治療會(huì)導(dǎo)致平均 在2. 8年內(nèi)死亡。肺循環(huán)增加的收縮導(dǎo)致對(duì)右側(cè)心臟增加壓力，這可發(fā)展成為右側(cè)心 臟衰竭。根據(jù)定義，對(duì)于慢性肺動(dòng)脈高血壓，平均肺動(dòng)脈血壓（mPAP)在靜息狀態(tài)時(shí)（at rest)>25mmHg (毫米采柱），或在用力（exertion)期間>30mmHg(正常值<20mmHg)。肺動(dòng) 脈高血壓的病理生理特征在于肺血管的血管收縮和重塑。在慢性PAH中，存在初始非肌 化（unmuscularized)的肺血管的新肌化（neomuscularization)，以及已經(jīng)肌化血管的血 管肌肉在周長上的增加。這種增加的肺循環(huán)閉塞導(dǎo)致對(duì)右側(cè)心臟的漸增的壓力，從而導(dǎo) 致從右側(cè)心臟的輸出降低，最終右側(cè)心臟衰竭（M. Humbert等，J. Am. Coll. Cardiol. 2004， 43,13S-24S)。PAH是一種極為罕見的疾病，具有百萬分之一至二的患病率。這些患者的 平均年齡估計(jì)為36歲，只有10%的患者超過60歲。明顯地，比男性更多的女性受到影響 (G. E. D，Alonzo 等，Ann. Intern. Med. 1991，115, 343-349) 〇
[0005] 在市場上有效的標(biāo)準(zhǔn)療法（例如前列環(huán)素類似物、內(nèi)皮素受體拮抗劑、磷酸二酯 酶抑制劑）能提高生活質(zhì)量、運(yùn)動(dòng)耐量和患者的預(yù)后。這些療法的原理主要是影響血管張 力的血液動(dòng)力學(xué)，但其對(duì)致病的重塑過程沒有直接的影響。此外，使用這些藥物的可能性通 過有時(shí)嚴(yán)重的副作用和/或復(fù)雜的給藥類型被限制。在通過特定的單藥治療改善或穩(wěn)定患 者的臨床表現(xiàn)的時(shí)期是有限的。最終療法升級(jí)，從而必須同時(shí)給予多個(gè)藥物的聯(lián)合療法被 應(yīng)用。盡管在肺動(dòng)脈高血壓的療法中具有如此進(jìn)步，然而治愈這樣嚴(yán)重的疾病仍沒有前景。
[0006] 術(shù)語外周血管疾?。≒VD)，是指在外周動(dòng)脈和靜脈內(nèi)的損傷、功能紊亂或障礙。外 周動(dòng)脈疾病是PVD的最常見形式。外周血管疾病是最常見的動(dòng)脈疾病，并且在美國是一個(gè) 非常普遍的情況。它主要在大于50歲的人群中發(fā)生。外周血管疾病是50歲以上的人群中 以及在那些患有糖尿病的人群中殘疾的首要原因。在美國大約有一千萬人有外周血管疾 病，相當(dāng)于大于50歲的人群的約5%。預(yù)計(jì)具有這種情況的人群的數(shù)量隨著人口老齡化而 增長。與女性相比，男性具有外周血管疾病略少。
[0007] 深度外周動(dòng)脈閉塞引起的嚴(yán)重肢體缺血（CLI)的特征在于在靜息時(shí)血流量 和氧遞送的減少，導(dǎo)致在靜息時(shí)肌肉疼痛并且未愈合的皮膚潰瘍或壞疽（Rissanen 等，Eur.J. Clin. Invest 31:651-666 (2001) ;Dormandy 和 Rutherford, J. Vase. Surg. 31: S1-S296 (2000))。預(yù)計(jì)在一年中嚴(yán)重肢體缺血每百萬人中發(fā)展500至1000 人（"Second European Consensus Document on Chronic Critical Leg Ischemia''， Circulation 84(增刊4) IV 1-26(1991))。在具有嚴(yán)重肢體缺血的患者中，盡管 其相關(guān)的發(fā)病率、死亡率和功能影響，然而截肢還經(jīng)常被建議作為用于傷殘癥狀的 解決方案（M.R. Tyrrell 等，Br. J. Surg. 80:177-180 (1993) ;M. Eneroth 等，Int. Orthop. 16:383-387(1992))。對(duì)于嚴(yán)重肢體缺血，不存在最佳的藥物療法（Circulation 84(4Suppl.) :IV 1-26(1991)) 〇
[0008] 冠狀動(dòng)脈疾?。▌?dòng)脈粥樣硬化）是人類的進(jìn)行性疾病，其中一個(gè)或多個(gè)冠狀動(dòng)脈 通過斑塊的積聚逐漸變得堵塞。具有這種疾病的患者的冠狀動(dòng)脈通常通過球囊血管成形術(shù) 或插入支架以撐開部分堵塞的動(dòng)脈來治療。最終，這些患者需要承受冠狀動(dòng)脈搭橋手術(shù)的 巨大代價(jià)和風(fēng)險(xiǎn)。
[0009] 現(xiàn)在已經(jīng)驚奇地發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞和它的外來體成分，當(dāng)其與前列環(huán)素和/或 上皮的祖細(xì)胞聯(lián)合給藥時(shí)，在血管病變的治療中是有用的，該血管病變包括肺動(dòng)脈高血壓 (PAH)和其它類型的肺高血壓、外周血管疾?。≒VD)、嚴(yán)重肢體缺血（CLI)、冠狀動(dòng)脈疾病和 糖尿病性血管病變。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種用于治療或預(yù)防血管病變的方法，其包括將 藥物組合物給藥至有需要的對(duì)象，該藥物組合物包括間充質(zhì)前體細(xì)胞（MPC)和前列環(huán)素。 待治療的對(duì)象可以是人類。在其它實(shí)施方式中，MPC被遺傳修飾，MPC從對(duì)象獲得、從骨髓獲 得、或與內(nèi)皮祖細(xì)胞聯(lián)合給藥。
[0011] 在其它實(shí)施方式中，藥物組合物還包括至少一種藥學(xué)上可接受的載體或至少一種 治療劑。在另一個(gè)實(shí)施方式中，對(duì)象患有肺動(dòng)脈高血壓（PAH)、外周血管疾病（PVD)、嚴(yán)重肢 體缺血（CLI)、冠狀動(dòng)脈疾病或糖尿病性血管病變。在其它實(shí)施方式中，當(dāng)前的方法減少在 肺動(dòng)脈中的血栓、減少在肺動(dòng)脈中的炎癥、減少在肺動(dòng)脈中的內(nèi)膜平滑肌的增殖、減少在肺 動(dòng)脈中叢狀病變的形成、增加在肺動(dòng)脈中一氧化氮的量、增加在肺動(dòng)脈中PGI 2的量、減少在 肺動(dòng)脈中內(nèi)皮素-1的含量、或減少在肺動(dòng)脈中生長因子的量。在其它實(shí)施方式中，當(dāng)前的 方法促進(jìn)了在肺動(dòng)脈中合適的內(nèi)皮形態(tài)。在其它實(shí)施方式中，將MPC與前列腺素 I2 (PGI2)、 前列環(huán)素類似物、磷酸二酯酶-5 (PDE-5)抑制劑、內(nèi)皮素受體拮抗劑（ETRA)、酪氨酸激酶抑 制劑和可溶性鳥苷酸環(huán)化酶刺激劑中的至少一種聯(lián)合給藥至對(duì)象。
[0012] 在一個(gè)實(shí)施方式中，本公開涉及用于在有需要的對(duì)象中治療或預(yù)防血管病變的方 法，該方法包括將前列環(huán)素、以及包括間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC)或包括已經(jīng)與MSC接觸且包含一 種或多種MSC組分的培養(yǎng)基的一部分的組合物給藥至對(duì)象。前列環(huán)素和該組合物可以被同 時(shí)給藥或單獨(dú)給藥。
[0013] 在一些實(shí)施方式中，在給藥之前，MSC已經(jīng)與前列環(huán)素接觸。同樣地，在這種給藥 之前，可以將培養(yǎng)基或從中獲得該培養(yǎng)基的MSC放置與前列環(huán)素接觸。因此，在一些實(shí)施方 式中，該方法還包括這種前處理步驟。
[0014] 從部分MSC培養(yǎng)物獲得的成分的非限制性的例子包括外來體、微泡、微小RNAJf 使RNA、非編碼RNA、線粒體、生長因子、以及它們的組合。
[0015] 在一個(gè)方面，這種方法還需要將內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPC)給藥至對(duì)象。在一個(gè)方面， EPC從對(duì)象獲得。在一些方面，EPC進(jìn)行核酸轉(zhuǎn)化，該核酸增加選自內(nèi)皮型一氧化氮合成酶 (eNOS)、血紅素氧化酶（HMOXl)和前列環(huán)素合成酶（PTGIS)中的蛋白質(zhì)的生物活性的表達(dá)。 在一個(gè)方面中，該核酸編碼該蛋白質(zhì)。
[0016] 前列環(huán)素的例子包括但不限于依前列醇鈉、曲前列環(huán)素、貝前列素、伊洛前列素和 PGI2受體激動(dòng)劑。在一個(gè)方面，前列環(huán)素為曲前列環(huán)素或其藥學(xué)上可接受的鹽或酯。
[0017] 在實(shí)施方式中還提供了一種藥物組合物，該藥物組合物包括治療有效量的前列環(huán) 素以及包括間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC)或已經(jīng)與MSC接觸且包含從MSC釋放的化合物的培養(yǎng)基的 組合物、和藥學(xué)上可接受的載體。在一些方面，該藥物組合物還包括內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPC)。
[0018] 另一個(gè)實(shí)施方式還提供了一種制備包括間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC)或培養(yǎng)基的組合物 的方法，該培養(yǎng)基已經(jīng)與MSC接觸且包含從MSC釋放的用于體內(nèi)遞送的化合物，該方法包括 將MSC和前列環(huán)素接觸。由這種方法制得的處理后的組合物也被提供。
[0019] 在其它實(shí)施方式中，藥物組合物還包括至少一種藥學(xué)上可接受的載體或至少一種 治療劑。在另一個(gè)實(shí)施方式中，對(duì)象患有血管病變，例如肺動(dòng)脈高血壓（PAH)、外周血管疾 ?。≒VD)、嚴(yán)重肢體缺血（CLI)、冠狀動(dòng)脈疾病或糖尿病性血管病變。在其它實(shí)施方式中，當(dāng) 前的方法減少在肺動(dòng)脈中的血栓、減少在肺動(dòng)脈中的炎癥、減少在肺動(dòng)脈中的內(nèi)膜平滑肌 的增殖、減少在肺動(dòng)脈中叢狀病變的形成、增加在肺動(dòng)脈中一氧化氮的量、增加在肺動(dòng)脈中 PGI2的量、減少在肺動(dòng)脈中內(nèi)皮素-1的含量、或減少在肺動(dòng)脈中生長因子的量。在其它實(shí) 施方式中，當(dāng)前的方法促進(jìn)在肺動(dòng)脈中合適的內(nèi)皮形態(tài)。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 除非另有指明，否則"一"或"一個(gè)"是指"一個(gè)或多個(gè)"。
[0021] 除非特別限定，否則本文使用的所有技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語應(yīng)被視為具有與本領(lǐng)域 (例如在干細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)、免疫學(xué)、免疫組織化學(xué)、蛋白質(zhì)化學(xué)和生物 化學(xué)中）的普通技術(shù)人員理解的相同的含義。
[0022] 除非另有說明，否則在本發(fā)明中使用的重組蛋白質(zhì)、細(xì)胞培養(yǎng)和免疫學(xué)技術(shù)是本 領(lǐng)域的技術(shù)人員所公知的標(biāo)準(zhǔn)方法。這種技術(shù)通過文獻(xiàn)來源來描述和解釋，例如J. Perbal， A Practical Guide to Molecular Cloning，John Wiley 和 Sons(1984) ;J. Sambrook 等， Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbour 實(shí)驗(yàn)室出版社（1989); T. A. Brown (編輯），Essential Molecular Biology :A Practical Approach，第 I 卷和第 2 卷，IRL 出版社（1991) ;D.M· Glover 和 B.D. Hames (編輯），DNA Cloning:A Practical Approach，第 1-4卷，IRL 出版社（1995 年和 1996 年）；以及F. M. Ausubel 等（編輯），Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub. Associates和 Wiley-Interscience(1988 年，包括直到目前的所有更新）；Ed Harlow和David Lane(編輯）Antibodies:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbour 實(shí)驗(yàn)室（I988);以及 J.E. Coligan 等（編輯） Current Protocols in Immunology，John Wiley&Sons (包括直到目前的所有更新），并且 其通過引用并入本文。
[0023] 如本文所用，術(shù)語"對(duì)象"（在本文也被稱為"患者"）包括溫血?jiǎng)游?，?yōu)選哺乳動(dòng) 物，包括人。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，對(duì)象為靈長類動(dòng)物。在一個(gè)甚至多個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式 中，對(duì)象是人。
[0024] 如本文所用的術(shù)語"治療（treating) "、"治療（treat) "或"治療（treatment) "包 括給藥治療有效量的足以減少或消除至少一種血管病變的癥狀的如本文限定的細(xì)胞。
[0025] 如本文所用的術(shù)語"預(yù)防（preventing) "、"預(yù)防（prevent) "或"預(yù)防 (prevention)"包括給藥治療有效量的足以阻止或阻礙至少一種血管病變的癥狀的發(fā)展的 如本文限定的細(xì)胞。
[0026] 如本文所用，術(shù)語"干細(xì)胞"是指自我更新的細(xì)胞，其能夠產(chǎn)生表型和基因型完全 相同的子代以及至少一種其它最終的細(xì)胞類型（例如，末端分化細(xì)胞）。術(shù)語"干細(xì)胞"包括 全能性的（totipotential)、多能性的（pluripotential)和多潛能性的（multipotential) 細(xì)胞、以及源自其分化的祖細(xì)胞和/或前體細(xì)胞。
[0027] 如本文所用，術(shù)語"全能細(xì)胞"或"全能性的細(xì)胞"是指能夠形成完整的胚胎（例 如胚泡）的細(xì)胞。
[0028] 如本文所用，術(shù)語"多能細(xì)胞"或"多能性的細(xì)胞"是指具有完全分化的多功能性 (即成長為任何哺乳動(dòng)物體的約260種細(xì)胞類型的能力）的細(xì)胞。多能細(xì)胞可以自我更新， 并能在組織內(nèi)保持休眠或靜態(tài)。
[0029] 所謂"多潛能性的細(xì)胞"或"多潛能細(xì)胞"是指能夠產(chǎn)生任何幾種成熟細(xì)胞類型的 細(xì)胞。如本文所用，這個(gè)短語包含了成年的或胚胎的干細(xì)胞和祖細(xì)胞，以及這些細(xì)胞的多潛 能性的后代。與多能細(xì)胞不同，多潛能細(xì)胞不具有形成所有細(xì)胞類型的能力。
[0030] 如本文所用，術(shù)語"祖細(xì)胞"是指致力于分化成特定類型的細(xì)胞或形成特定類型的 組織的細(xì)胞。
[0031] 間充質(zhì)前體細(xì)胞（MPC)是在骨髓、血液、牙髓細(xì)胞、脂肪組織、皮膚、脾、胰腺、腦、 腎、肝、心臟、視網(wǎng)膜、腦、毛囊、腸、肺、淋巴結(jié)、胸腺、骨、韌帶、腱、骨骼肌、真皮和骨膜中發(fā) 現(xiàn)的細(xì)胞；并且其能夠分化成不同的生殖細(xì)胞系，例如中胚層、內(nèi)胚層和外胚層。因此，MPC 能夠分化成大量的細(xì)胞類型，包括但不限于脂肪組織、骨組織、軟骨組織、彈性組織、肌肉組 織和纖維結(jié)締組織。這些細(xì)胞進(jìn)入的特定譜系定向和分化途徑取決于來自力學(xué)影響和/或 內(nèi)源的生物活性因子（例如生長因子、細(xì)胞因子）和/或由宿主組織建立的局部微環(huán)境條 件的各種影響。因此MPC為非造血祖細(xì)胞，其分裂產(chǎn)生子細(xì)胞（干細(xì)胞或前體細(xì)胞），干細(xì) 胞或前體細(xì)胞將