及時不可逆地分化產(chǎn)生表型細(xì)胞。
[0032] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，在本發(fā)明的方法中使用的細(xì)胞從自對象獲得的樣品中富 集。本文的術(shù)語"富集的（enriched) "、"富集（enrichment)"或其變型用來描述細(xì)胞群，其 中相比未處理的群，一種特定的細(xì)胞類型的比例或若干特定的細(xì)胞類型的比例增加。
[0033] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，在本發(fā)明中使用的細(xì)胞是TNAP+、STRO-Γ、VCAM-Γ、ΤΗΥ-Γ、 STRO-2+、CD45+、CD146+、3G5+或它們的任一組合。
[0034] 對于給出的標(biāo)記，當(dāng)稱細(xì)胞為"陽性"時，根據(jù)該標(biāo)記在細(xì)胞表面上存在的程度，其 可為該標(biāo)記的低的（1〇或暗的）表達(dá)者或高的（亮的，bri)表達(dá)者，其中該術(shù)語涉及熒光 強(qiáng)度或在細(xì)胞的顏色分選過程中所使用的其它顏色的強(qiáng)度。在被分選的特定細(xì)胞群上使用 的標(biāo)記的上下文中，將會理解1〇(或暗的或不明亮的）和bri的區(qū)別。對于給出的標(biāo)記，當(dāng) 本文中稱細(xì)胞為"陰性"時，這并不意味著該標(biāo)記根本不被該細(xì)胞所表達(dá)。這意味著，該標(biāo) 記被該細(xì)胞以相對非常低的水平表達(dá)，并且當(dāng)可檢測地示蹤時，其產(chǎn)生非常弱的信號。
[0035] 當(dāng)本文所用的術(shù)語"TNAP"旨在包含組織非特異性堿性磷酸酶的所有亞型 (isoform)。例如，該術(shù)語包括肝亞型（LAP)、骨亞型（BAP)和腎亞型（KAP)。在優(yōu)選的實(shí) 施方式中，TNAP為BAP。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，本文中所用的TNAP是指可結(jié)合STR0-3 抗體的分子，該抗體由雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生，該雜交瘤細(xì)胞系根據(jù)布達(dá)佩斯條約（Budapest Treaty)的規(guī)定在2005年12月19日以保藏號為PTA-7282保藏在ATCC中。
[0036] 優(yōu)選地，相當(dāng)大比例的多潛能細(xì)胞能夠分化成至少兩種不同的生殖細(xì)胞系。該多 潛能細(xì)胞可定向的譜系的非限制性的例子包括血管內(nèi)皮細(xì)胞；平滑肌細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞； 骨前體細(xì)胞；肝祖細(xì)胞，其對膽管上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞是多潛能的；神經(jīng)限制細(xì)胞，其可產(chǎn)生 神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的前體，該前體發(fā)展成少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞；發(fā)展為神經(jīng)元的神經(jīng) 前體；心肌前體和心肌細(xì)胞，葡萄糖反應(yīng)性的胰島素分泌胰腺β細(xì)胞系。其它譜系包括但 不限于成牙質(zhì)細(xì)胞、牙質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞和軟骨細(xì)胞，及以下細(xì)胞的前體細(xì)胞：視網(wǎng)膜色素上皮細(xì) 胞、成纖維細(xì)胞、皮膚細(xì)胞（如角質(zhì)細(xì)胞）、樹突狀細(xì)胞、毛囊細(xì)胞、腎管上皮細(xì)胞、睪丸祖細(xì) 胞、腱、韌帶、軟骨、脂肪細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、骨髓基質(zhì)、心肌、平滑肌、骨骼肌、周皮細(xì)胞、血管 細(xì)胞、上皮細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。
[0037] 在一個實(shí)施方式中，"多潛能細(xì)胞"在培養(yǎng)時不能夠產(chǎn)生造血細(xì)胞。
[0038] 用于本發(fā)明的方法的干細(xì)胞可以來自成人組織、胚胎、或胎兒。使用的術(shù)語"成人" 以其最廣泛的含義包括出生后的對象。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，術(shù)語"成人"是指青春期后的 對象。本文所用的術(shù)語"成人"也可包括取自女性的臍帶血。
[0039] 本發(fā)明還涉及使用后代細(xì)胞（其也可以被稱為擴(kuò)增的細(xì)胞），其從本文所述的干 細(xì)胞在體外培養(yǎng)產(chǎn)生。根據(jù)培養(yǎng)條件（包括在培養(yǎng)基中刺激因子的數(shù)目和/或類型）、代 的數(shù)目等，本發(fā)明的擴(kuò)增的細(xì)胞可具有各種各樣的表型。在某些實(shí)施方式中，后代細(xì)胞從親 本群在約2代、約3代、約4代、約5代、約6代、約7代、約8代、約9代、或約10代后獲得。 然而，后代細(xì)胞可以從親本群的任何數(shù)目的代之后獲得。
[0040] 該后代細(xì)胞可以在任何合適的介質(zhì)中培養(yǎng)而獲得。關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)所用的術(shù)語"介 質(zhì)"，包括細(xì)胞周圍環(huán)境的成分。介質(zhì)可以是固體、液體、氣體或相和材料的混合物。介質(zhì)包 括液體生長介質(zhì)以及不維持細(xì)胞生長的液體介質(zhì)。介質(zhì)還包括凝膠狀介質(zhì)（例如瓊脂）、瓊 脂糖、明膠和膠原蛋白基質(zhì)。術(shù)語"介質(zhì)"也指用于細(xì)胞培養(yǎng)中的材料，即使它尚未與細(xì)胞 接觸。換句話說，用于細(xì)菌培養(yǎng)而制備的營養(yǎng)豐富的液體是介質(zhì)。
[0041] 在實(shí)施方式中，用于本發(fā)明的方法的后代細(xì)胞通過使用STR0-3抗體標(biāo)記的磁珠 從骨髓中分離TNAP+細(xì)胞，并平鋪在補(bǔ)充有20%的胎牛血清、2mM的L-谷氨酰胺和100 μ m 的L-抗壞血酸-2-磷酸的a -MEM中來獲得。
[0042] 在一個實(shí)施方式中，這種擴(kuò)增的細(xì)胞（至少在5代之后）可以是TNAP-、CC9+、HLA 類 I+、HLA 類 II-、CD14-、CD19- ;CD3-、CDlla-C-、CD31-、CD86-和 / 或 CD80-。然而，對本 文所述的那些在不同的培養(yǎng)條件下，不同標(biāo)記的表達(dá)可以改變。此外，雖然這些表型的細(xì)胞 可以在消耗的細(xì)胞群中占主導(dǎo)地位，但是并不意味著不存在小比例的不具有這種表型的細(xì) 胞（例如，小部分?jǐn)U增的細(xì)胞可以是CC9-)。在一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的擴(kuò)增細(xì)胞 仍然具有分化成不同細(xì)胞類型的能力。
[0043] 在一個實(shí)施方式中，在本發(fā)明的方法中使用的消耗的細(xì)胞群包括這樣的細(xì)胞，其 中，該細(xì)胞的至少25 %為CC9+，更優(yōu)選至少50 %為CC9+。
[0044] 在另一個實(shí)施方式中，在本發(fā)明的方法中使用的消耗的細(xì)胞群包括細(xì)胞，其中，該 細(xì)胞的至少40%為3了1?0-1+，更優(yōu)選至少45%為311?0-1+。
[0045] 在另一實(shí)施方式中，后代細(xì)胞可以表達(dá)標(biāo)記，該標(biāo)記選自LFA-3、THY-1、VCAM-1、 PECAM-1、P-選擇素、L-選擇素、3G5、CD49a/CD49b/CD29、CD49c/CD29、CD49d/CD29、CD29、 CD18、CD61、整合素 β、6-19、血栓調(diào)節(jié)蛋白、CD10、CD13、SCF、PDGF-R、EGF-R、IGF1-R、NGF-R、 FGF-R、瘦素-R、（STRO-2 =瘦素-R)、RANKL、STRO-I亮和CD146或這些標(biāo)記的任一組合。
[0046] 在一個實(shí)施方式中，后代細(xì)胞是在WO 2006/032092中限定的多潛能擴(kuò)增的MPC后 代（MEMPs)。在WO 01/04268和WO 2004/085630中描述了用于制備MPC的富集群的方法， 后代可源自該MPC。在體外環(huán)境中，MPC很少會以完全純化的制備存在，而是通常與其它細(xì) 胞存在，其它細(xì)胞為組織特異性定型細(xì)胞（TSCCs)。WO 01/04268涉及從骨髓中以約0.1% 至90%的純度含量采集這種細(xì)胞。包括從中可得到后代的MPC的群可從組織來源直接采 集，或者可替選地可以是已經(jīng)離體擴(kuò)增的群。
[0047] 例如，該后代可以從采集的、未擴(kuò)增的、基本上純化的MPC的群中獲得，其占它們 存在的群的總細(xì)胞的至少約 〇. 1%、1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80% 或95%。例如，這個含量可以通過選擇對于至少一種標(biāo)記是陽性的細(xì)胞來獲得，至少一種標(biāo) 記選自 TNAP、STRO-Ibri、3G5+、VCAM-1、THY-I、CD 146 和 STR0-2。
[0048] MPC起始群可源自于在WO 01/04268或WO 2004/085630中記載的任何一種或多種 組織類型，即骨髓、牙髓細(xì)胞、脂肪組織和皮膚，或可更廣泛地來自脂肪組織、牙齒、牙髓、皮 膚、肝、腎、心臟、視網(wǎng)膜、腦、毛囊、腸、肺、脾、淋巴結(jié)、胸腺、胰腺、骨、韌帶、骨髓、腱和骨骼 肌。
[0049] MEMPS不同于新采集的MPC，因?yàn)樗鼈儗τ跇?biāo)記STRO-Ibri陽性，對于標(biāo)記堿性磷 酸酶（ALP)陰性。與此相反，新分離的MPC對于STROUP ALP都是陽性。在本發(fā)明的優(yōu)選 實(shí)施方式中，至少15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%的給藥的細(xì) 胞具有表型STR〇-l bl:i、ALP-。在又一優(yōu)選的實(shí)施方式中，對于標(biāo)記Ki67、CD44和/或CD49c/ ⑶29、VLA-3、α 3β 1中的一種或多種，MEMPS陽性。還在又一優(yōu)選的實(shí)施方式中，MEMP不表 現(xiàn)出TERT活性和/或?qū)τ跇?biāo)記⑶18陰性。
[0050] 在一個實(shí)施方式中，細(xì)胞取自具有血管病變的患者，使用標(biāo)準(zhǔn)方法體外培養(yǎng)，并作 為自體移植物或異體移植物給藥至患者。在可替選的實(shí)施方式中，建立的人類細(xì)胞系的一 種或多種細(xì)胞被使用。在本發(fā)明的另一個有用的實(shí)施方式中，非人類的動物細(xì)胞（或若該 患者不是人類，則來自另一個物種）被使用。
[0051] 本發(fā)明可以使用來自任何非人類的動物物種的細(xì)胞來實(shí)施，該細(xì)胞包括但不限于 非人類的靈長類動物細(xì)胞、有蹄類動物細(xì)胞、犬類動物細(xì)胞、貓類動物細(xì)胞、兔類動物細(xì)胞、 嚙齒類動物細(xì)胞、鳥類細(xì)胞和魚類細(xì)胞。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的靈長類動物細(xì)胞可以包括但不限于 黑猩猩細(xì)胞、狒狒細(xì)胞、食蟹猴細(xì)胞、和任何其它新大陸（New World)猴細(xì)胞或舊大陸（Old World)猴細(xì)胞?？蓪?shí)現(xiàn)本發(fā)明的有蹄類動物細(xì)胞包括但不限于牛細(xì)胞、豬細(xì)胞、綿羊細(xì)胞、 公山羊細(xì)胞、馬細(xì)胞、水牛細(xì)胞和野牛細(xì)胞?？蓪?shí)現(xiàn)本發(fā)明的嚙齒類動物細(xì)胞包括但不限于 小鼠細(xì)胞、大鼠細(xì)胞、豚鼠細(xì)胞、倉鼠細(xì)胞和沙鼠細(xì)胞?？蓪?shí)現(xiàn)本發(fā)明的兔類動物的物種的 例子包括馴化兔、杰克兔、野兔、棉尾兔、雪地兔和鼠兔。雞（原雞（Gallus gallus))是可 實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的禽類物種的一個例子。
[0052] 用于本發(fā)明的方法的細(xì)胞在使用前可被儲存。用于保存和儲存真核細(xì)胞（特 別是哺乳動物細(xì)胞）的方法和方案是本領(lǐng)域眾所周知的（參見，例如，Pollard, J.W.和 Walker, J.M. (1997) Basic Cell Culture Protocols，第二版，Humana 出版社，Totowa,新澤 西州；Freshney, R. I. (2000)Culture of Animal Cells，第四版，Wiley-Liss，Hoboken,新 澤西州）。任何保持分離的干細(xì)胞的生物活性的方法可以被用于本發(fā)明中，干細(xì)胞例如間充 質(zhì)干細(xì)胞/祖細(xì)胞、或其后代。在一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過使用冷凍保存將細(xì)胞維持并 儲存。
[0053] 用于本發(fā)明的方法的細(xì)胞可使用多種方法獲得。例如，利用一些細(xì)胞分選技術(shù)，通 過參考與細(xì)胞-抗體復(fù)合物相關(guān)的性質(zhì)，或使用附接到抗體的標(biāo)記使細(xì)胞被物理地分開。 該標(biāo)記可以是磁性顆粒或熒光分子?？贵w可以是交聯(lián)的，使得它們形成多個細(xì)胞的聚集體， 其根據(jù)它們的密度可分開?？商孢x地，抗體可以附接到固定基質(zhì)（所期望的細(xì)胞附著到固 定基質(zhì)）。
[0054] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，結(jié)合 TNAP+、STR0-1+、VCAM-1+、THY-1+、STR0-2+、3G5+、 ⑶45+、⑶146+的抗體（或其它結(jié)合劑）被用于分離細(xì)胞。更優(yōu)選地，結(jié)合TNAP+或STR0-1+ 的抗體（或其它結(jié)合劑）被用于分離細(xì)胞。
[0055] 分開未結(jié)合抗體的細(xì)胞和抗體結(jié)合的細(xì)胞的多種方法是已知的。例如，結(jié)合細(xì)胞 (或抗同種型抗體）的抗體可以被標(biāo)記，然后通過機(jī)械細(xì)胞分選儀檢測標(biāo)記的存在來分離 細(xì)胞。熒光激活細(xì)胞分選儀是本領(lǐng)域公知的。在一個實(shí)施方式中，抗TNAP抗體和/或STR0-1 抗體被附接到固體載體上。各種固體載體對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的，包括但不限于瓊 脂糖珠、聚苯乙烯珠、中空纖維膜、聚合物和塑料培養(yǎng)皿?？贵w結(jié)合的細(xì)胞可以通過將固體 載體與細(xì)胞懸浮液簡單地物理分開而從細(xì)胞懸浮液中除去。
[0056] 超順磁性微?？梢杂糜诩?xì)胞分離。例如，微粒可涂覆有抗-TNAP抗體和/或STR0-1 抗體。然后可以將抗體標(biāo)記的超順磁性微粒用含有感興趣的細(xì)胞的溶液培育。微粒結(jié)合到 期望的干細(xì)胞的表面上，然后可以將這些細(xì)胞在磁場中收集。
[0057] 在另一個實(shí)施例中，細(xì)胞樣品被允許物理接觸，例如，固相連接的抗-TNAP單克隆 抗體和/或抗-STR0-1的單克隆抗體。固相連接可以包括，例如使抗體吸附至塑料、硝化纖 維、或其它表面上。該抗體也可吸附到中空纖維膜的大孔（足夠大，以允許細(xì)胞流過）的壁 上?？商孢x地，抗體可以共價連接至珠的表面，如Pharmacia瓊脂糖6MB的巨珠。對于固相 連接的抗體與含有干細(xì)胞的懸浮液的嚴(yán)格的培育條件和時間取決于所采用的涉及該系統(tǒng) 的幾個因素。然而，合適條件的選擇是本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的。
[0058] 在足夠的時間使干細(xì)胞被結(jié)合之后，然后將未結(jié)合的細(xì)胞用生理緩沖液洗脫或洗 去。未結(jié)合的細(xì)胞可被回收并用于其它用途或在已經(jīng)完成適當(dāng)?shù)臋z測以確保已經(jīng)達(dá)到所期 望的分離之后丟棄。然后主要根據(jù)固相和抗體的性質(zhì)，通過任何合適的方法將結(jié)合的細(xì)胞 與固相分開。例如，通過劇烈攪拌將結(jié)合的細(xì)胞從塑料培養(yǎng)皿上洗脫?？商孢x地，結(jié)合的細(xì) 胞可通過酶"切斷"或消化在固相和抗體之間的酶敏感的"間隔區(qū)"序列而被洗脫。結(jié)合到 瓊脂糖珠上的間隔區(qū)可從例如Pharmacia購買到。
[0059] 然后將洗脫的富集的細(xì)胞部分（fraction)用緩沖液通過離心分離洗滌，所述的 富集部分可根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)以活的狀態(tài)被冷凍保存以用于以后使用、培養(yǎng)擴(kuò)增和/或引入到 患者體內(nèi)。
[0060] 典型地，細(xì)胞以藥物組合物的形式進(jìn)行給藥，該藥物組合物包括至少一種藥學(xué)上 可接受的載體。短語"藥學(xué)上可接受的"是指在合乎邏輯的醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)、與合理的利益 /風(fēng)險比相稱的那些化合物、材料、組合物和/或劑型，其適合用于與人類和動物的組織接 觸而沒有過度的毒性、刺激性、過敏性反應(yīng)或其它問題或并發(fā)癥。如本文所用的短語"藥學(xué) 上可接受的載體"是指藥學(xué)上可接受的材料、組合物或媒介物，例如液體填充劑或固體填充 劑、稀釋劑、賦形劑或溶劑封裝材料。
[0061] 藥學(xué)上可接受的載體包括鹽水、含水緩沖溶液、溶劑和/或分散介質(zhì)。這種載體的 使用是本領(lǐng)域公知的。該溶液優(yōu)選是無菌的并且易于注射程度存在的流體。優(yōu)選地，該溶 液在制造和儲存的條件下是穩(wěn)定的，并且通過例如對羥基苯甲酸酯類、氯丁醇、苯酚、抗壞 血酸、硫柳汞