聚乙二醇化的oxm變體的制作方法
【技術領域】
[0001] 公開了一種組合物，其包括經由可逆連接基團連接的胃泌酸調節(jié)素和聚乙二醇聚 合物（PEG聚合物），所述可逆連接基團例如9-芴基甲氧羰基（Fmoc)或2-磺基-9-芴基甲 氧羰基（FMS)。還公開了包含可逆聚乙二醇化胃泌酸調節(jié)素的藥物組合物和其使用方法。
【背景技術】
[0002] 胃腸道負責合成和釋放多種調控進食行為的肽激素，包括胰腺蛋白（PP)、胰高血 糖素樣肽I (GLP-I)、肽YY(PYY)和胃泌酸調節(jié)素（OXM)。OXM由腸道和CNS中的胰高血糖素 原的組織特異性翻譯后加工產生。它含有37個氨基酸，包括具有C末端堿性八肽延伸的完 整胰高血糖素序列，所述堿性八肽延伸被證明體外和體內都有助于OXM的性質，但對于肽 的作用而言，單獨的所述堿性八肽延伸是不足夠的。響應于食物攝入，OXM由腸道L細胞與 膳食熱量含量成比例地分泌到血流中。
[0003] OXM在口服和腹膜內施用之后經由刺激胰島素分泌而增強葡萄糖清除。它還調控 食物攝入的控制。將OXM腦室內（ICV)和核內注射到下丘腦的室旁核和弓狀核（ARC)中抑 制了空腹大鼠的再攝食。此抑制在自由攝食的大鼠中在黑暗期開始時也已經得到證實。此 外，外周施用OXM劑量依賴性地抑制空腹誘導的和黑暗期的食物攝入。
[0004] 不利的藥物動力學（例如短暫的血清半衰期）可以防礙多種在其它方面有前景的 候選藥物的藥學開發(fā)。血清半衰期是分子的經驗特征，并且對于每種新的潛在藥物必須以 實驗方式測定。舉例來說，對較低分子量的蛋白質藥物，例如腎過濾的生理清除機制可以使 得維持藥物的治療水平因為所需給藥方案的成本或頻率而不可行。
[0005] 蛋白質，且尤其是短肽，在血液、肝臟或腎臟中易于變性或酶促降解。因此，蛋白質 通常具有幾小時的短暫循環(huán)半衰期。由于其低穩(wěn)定性，肽類藥物通常以持續(xù)頻率傳遞以便 維持活性肽的有效血漿濃度。此外，因為肽類藥物通常通過輸注來施用，頻繁注射肽類藥物 對對象引起相當大的不適。因此，需要可以延長治療性蛋白質和肽的半衰期同時維持其高 藥理學功效的技術。此類所要肽類藥物應該還符合以下要求：血清穩(wěn)定性增強、活性高并且 當注射到對象中時誘導不希望的免疫應答的概率低。
[0006] 本發(fā)明涉及OXM衍生物，其中利用可逆聚乙二醇化技術來延長肽的半衰期。

【發(fā)明內容】

[0007] 在一種實施方式中，本發(fā)明涉及一種組合物，其由胃泌酸調節(jié)素、聚乙二醇聚合物 (PEG聚合物）以及9-芴基甲氧羰基（Fmoc)或2-磺基-9-芴基甲氧羰基（FMS)組成，其中 所述PEG聚合物經由Fmoc或FMS與所述胃泌酸調節(jié)素的氨基末端連接。
[0008] 在一種實施方式中，本發(fā)明涉及一種組合物，其由胃泌酸調節(jié)素、聚乙二醇聚合物 (PEG聚合物）以及9-芴基甲氧羰基（Fmoc)或2-磺基-9-芴基甲氧羰基（FMS)組成，其中 所述PEG聚合物經由Fmoc或FMS與所述胃泌酸調節(jié)素的氨基酸序列的十二號位置上的賴 氨酸殘基（Lys 12)連接。
[0009] 在另一種實施方式中，本發(fā)明涉及一種組合物，其由胃泌酸調節(jié)素、聚乙二醇聚合 物（PEG聚合物）以及9-芴基甲氧羰基（Fmoc)或2-磺基-9-芴基甲氧羰基（FMS)組成， 其中所述PEG聚合物經由Fmoc或FMS與所述胃泌酸調節(jié)素的氨基酸序列的三十號位置上 的賴氨酸殘基（Lys3tl)連接。
[0010] 在一種實施方式中，本發(fā)明涉及一種改進胃泌酸調節(jié)素的曲線下面積（AUC)的方 法，其由以下步驟組成：使聚乙二醇聚合物（PEG聚合物）經由9-芴基甲氧羰基（Fmoc)或 2-磺基-9-芴基甲氧羰基（FMS)與所述胃泌酸調節(jié)素的氨基酸序列的12號位置上的賴氨 酸殘基或30號位置上的賴氨酸殘基或氨基末端綴合。
[0011] 在另一種實施方式中，本發(fā)明涉及一種降低胃泌酸調節(jié)素的給藥頻率的方法，其 由以下步驟組成：使聚乙二醇聚合物（PEG聚合物）經由9-芴基甲氧羰基（Fmoc)或2-磺 基-9-芴基甲氧羰基（FMS)與所述胃泌酸調節(jié)素的氨基酸序列的12號位置上的賴氨酸殘 基或30號位置上的賴氨酸殘基或氨基末端綴合。
[0012] 在另一種實施方式中，本發(fā)明涉及一種延長胃泌酸調節(jié)素的生物半衰期的方法， 其由以下步驟組成：使胃泌酸調節(jié)素、聚乙二醇聚合物（PEG聚合物）以及9-芴基甲氧羰基 (Fmoc)或2-磺基-9-芴基甲氧羰基（FMS)以1: 1:1的摩爾比綴合，其中所述PEG聚合物經 由9-芴基甲氧羰基（Fmoc)或2-磺基-9-芴基甲氧羰基（FMS)與所述胃泌酸調節(jié)素的氨 基酸序列的12號位置上的賴氨酸殘基或30號位置上的賴氨酸殘基或氨基末端綴合。
[0013] 通過以下詳細描述實例和附圖，本發(fā)明的其它特征和優(yōu)勢將是明顯的。然而，應理 解，當指明本發(fā)明的優(yōu)選實施方式時，所述詳細描述和特定實例示僅以說明方式給出，因為 由此詳細描述，本發(fā)明的精神和范圍內的各種變化和修改對本領域技術人員將是明顯的。
【附圖說明】
[0014] 圖1展示產生的PEG-FMS-0XM綴合物的不同變體。
[0015] 圖2是展示非均質PEG3q-FMS-OXM和三種PEG3q-FMS-OXM變體（氨基、Lysl2和 Lys30)當與過表達GLP-I受體的CHO-Kl細胞一起溫育時的體外活性（cAMP定量）的圖。
[0016] 圖3是展示非均質PEG3q-FMS-OXM和三種PEG3q-FMS-OXM變體（氨基、Lysl2和 Lys30)在IPGTT模型中的體內活性的圖。與運載工具（vehicle)組相比，所有化合物都誘 導葡萄糖耐受性。
[0017] 圖4展示非均質PEG30-FMS-0XM和三種PEG30-FMS-0XM變體（氨基、Lysl2和 Lys30)對于雄性ob/ob小鼠的體重的影響。
[0018] 圖5展示非均質PEG30-FMS-0XM和三種PEG30-FMS-0XM變體（氨基、Lysl2和 Lys30)對于雄性ob/ob小鼠的食物攝入的影響。
[0019] 圖6展示非均質PEG30-FMS-0XM和三種PEG30-FMS-0XM變體（氨基、Lysl2和 Lys30)對于雄性ob/ob小鼠的非空腹和空腹葡萄糖的影響。
[0020] 圖7展示M0D-6031、OXM和利拉魯肽（Iiraglutide)對于雄性ob/ob小鼠的累積 食物攝入的影響。
[0021] 圖8展示M0D-6031、OXM和利拉魯肽對于雄性ob/ob小鼠的體重的影響。
[0022] 圖9展示M0D-6031、OXM和利拉魯肽對于雄性ob/ob小鼠的自由攝食和空腹血漿 葡萄糖的影響。
[0023] 圖10展示在研究第2天M0D-6031和配對喂養(yǎng)組對于雄性ob/ob小鼠的葡萄糖耐 受性（2g/kg po)的影響。
[0024] 圖11展示在研究第30天M0D-6031和配對喂養(yǎng)組對于雄性ob/ob小鼠的葡萄糖 耐受性（2g/kg po)的影響。
[0025] 圖12展示M0D-603U0XM和利拉魯肽對于雄性ob/ob小鼠的最終血漿膽固醇的影 響。
[0026] 發(fā)明詳述
[0027] 本文中提供一種長效胃泌酸調節(jié)素以及其生產和使用方法。在一個方面，本發(fā)明 提供一種組合物，其包含或其組成為雙重GLP-I/胰高血糖素受體激動劑、聚乙二醇聚合物 (PEG聚合物）以及9-芴基甲氧羰基（Fmoc)或2-磺基-9-芴基甲氧羰基（FMS)。在另一 種實施方式中，本發(fā)明提供一種組合物，其包含或其組成為胃泌酸調節(jié)素、聚乙二醇聚合物 (PEG聚合物）以及9-芴基甲氧羰基（Fmoc)或2-磺基-9-芴基甲氧羰基（FMS)。在另一 種實施方式中，所述PEG聚合物經由Fmoc或FMS與胃泌酸調節(jié)素的氨基酸序列的十二號位 置上的賴氨酸殘基（Lys 12)連接。在一種實施方式中，長效胃泌酸調節(jié)素是一種組合物，其 包含或其組成為胃泌酸調節(jié)素和經由Fmoc或FMS與胃泌酸調節(jié)素的氨基酸序列的十二號 位置上的賴氨酸殘基（Lys 12)連接的聚乙二醇聚合物（PEG聚合物）。
[0028] 在另一個方面，本文中提供一種延長肽的血清半衰期的新方法。此方法基于聚乙 二醇（PEG)鏈與所述肽通過化學接頭（稱為FMS或Fmoc)的可逆連接，使得原生肽緩慢釋 放到血流中。然后，所釋放的肽還可以穿過血腦屏障以進入中樞神經系統(tǒng)（CNS)或任何其 它靶器官。在一種實施方式中，F(xiàn)MS接頭的獨特化學結構產生特定肽釋放速率。
[0029] 因此，在另一種實施方式中，本文中提供一種延長OXM肽的生物學半衰期的方法。 在另一種實施方式中，本文中提供一種延長OXM在生物學液體中的循環(huán)時間的方法，其中 通過緩慢釋放完整OXM肽來延長所述循環(huán)時間。在另一種實施方式中，延長所述OXM肽的 所述生物學半衰期或所述循環(huán)時間使得所述OXM可穿過血腦屏障并且靶向CNS。本領域技 術人員應充分了解，所述生物學液體可以是血液、血清、腦脊液（CSF)等。
[0030] 在一種實施方式中，在將本發(fā)明的聚乙二醇化胃泌酸調節(jié)素組合物施用到對象中 后，作為所述FMS或所述Fmoc接頭從所述組合物化學水解的結果，胃泌酸調節(jié)素釋放到對 象的生物學液體中。在另一種實施方式中，所釋放的胃泌酸調節(jié)素是完整的并且重新獲得 完全的GLP-I和胰高血糖素受體結合活性。在另一種實施方式中，使所述FMS或所述Fmoc 化學