細(xì) 胞脫落，氣管纖毛脫落嚴(yán)重，有的部位僅剩固有層與下面的軟骨組織相連；
[0037] 圖5a_圖5d為中藥益生菌復(fù)合制劑篩選動(dòng)物試驗(yàn)氣管顯微結(jié)構(gòu)觀察圖；其中，圖 5a :CK組假?gòu)?fù)層纖毛柱狀上皮細(xì)胞結(jié)合緊密，錯(cuò)落有致，纖毛緊密完整，粘膜層厚度均一； 圖5b :感染組G組大部分上皮細(xì)胞脫落，氣管纖毛脫落嚴(yán)重，有的部位僅剩固有層與下面的 軟骨組織相連；圖5c :Flp組氣管部分區(qū)域上皮細(xì)胞脫落，氣管纖毛脫落嚴(yán)重，有的部位僅 剩固有層與下面的軟骨組織相連；圖5d :F2p組上皮細(xì)胞結(jié)合緊密，粘膜層增厚，纖毛完整， 杯狀細(xì)胞清晰可見(jiàn)。
【具體實(shí)施方式】
[0038] 結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，應(yīng)該說(shuō)明的是，下述說(shuō)明僅是為了解釋本 發(fā)明，并不對(duì)其內(nèi)容進(jìn)行限定。
[0039] 實(shí)施例1 :致病菌的分離
[0040] L試驗(yàn)材料：
[0041] I. 1病料：無(wú)菌采集泰安市周邊患有呼吸道疾病雞的喉管、氣管、氣囊、肺臟。
[0042] 1. 2培養(yǎng)基：普通營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基（NA)、鮮血瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng) 基（EMB)、胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB)、SS培養(yǎng)基、麥 康凱培養(yǎng)基（MAC)、巧克力瓊脂培養(yǎng)基，上述培養(yǎng)基均購(gòu)于青島海博公司。
[0043] 0. 005%煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD)，購(gòu)于北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。
[0044] 1. 3生化微量鑒定管：乳糖、葡萄糖、精氨酸、木糖-明膠、MR-VP、丙二酸鹽、甘露 醇、衛(wèi)矛醇半固體、ONPG、西蒙氏枸櫞酸鹽、尿素酶、賴氨酸、無(wú)菌液體石蠟、Kovacs氏靛基質(zhì) 試劑盒，均購(gòu)自青島海博公司。
[0045] L 4分子生物學(xué)鑒定試劑：Taq DNA聚合酶（5IU/ μ L)、蛋白酶K、dNTPs、DNA提取 試劑盒，均由寶生物（大連）有限公司提供，_20°C保存。
[0046] 1. 5試驗(yàn)動(dòng)物：1日齡健康肉雞若干，購(gòu)自泰安大宇種禽廠。
[0047] 1.6試驗(yàn)日糧：購(gòu)自泰安六合飼料廠，飼料型號(hào)為510、511。1-21日齡飼喂510， 22-42日齡飼喂511。
[0048] 2.試驗(yàn)方法：
[0049] 2. 1細(xì)菌的分離培養(yǎng)：將無(wú)菌采集的病料喉管、氣管、氣囊、肺組織分別劃線接種 于EMB、MAC、TSA、鮮血瓊脂培養(yǎng)基、巧克力瓊脂培養(yǎng)基中，37°C恒溫培養(yǎng)。鮮血瓊脂培養(yǎng)基 與巧克力瓊脂培養(yǎng)基于5% (v/v)C02培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)。
[0050] 2. 2染色鏡檢：從各種選擇性培養(yǎng)基中挑取具有代表性的典型菌落涂片、革蘭氏 染色鏡檢、純化培養(yǎng)。保存菌種并標(biāo)記好作為生化鑒定、PCR檢測(cè)與藥敏試驗(yàn)的菌種。
[0051] 2. 3生化鑒定：將分離所得可疑桿菌的純培養(yǎng)物分別接種于乳糖、葡萄糖、精氨 酸、木糖-明膠、MR-VP、丙二酸鹽、甘露醇、衛(wèi)矛醇半固體、0NPG、西蒙氏枸櫞酸鹽、尿素酶、 賴氨酸生化微量鑒定管中，24h后觀察結(jié)果。另外對(duì)分離球菌進(jìn)行培養(yǎng)特性觀察。
[0052] 2. 4引物設(shè)計(jì)與合成：16S rDNA通用引物由上海生工生物工程有限公司合成。引 物序列如下：
[0053] F:5， -CGGCAACGAGCGCAACCC-3，，
[0054] R:5< -CCATTGTAGCACGTGTGTAGCC-3'。
[0055] 2. 5分子鑒定：細(xì)菌DNA的提取按照細(xì)菌DNA提取試劑盒提取說(shuō)明操作。以上述方 法提取得到的菌株DNA為模板，PCR反應(yīng)體系為50 μ L :模板2 μ L，PCR Master mix 25 μ L， CldH2O 21yL，上、下游引物（濃度均為10ymoL/L)各lyL，反應(yīng)條件為預(yù)變性94°C4min， 94°〇3〇8、56°〇8〇8、72°〇3〇8,30個(gè)循環(huán)，72°〇8111丨11。取1(^1^?0?產(chǎn)物用1%(111八）瓊脂 糖凝膠電泳，觀察PCR反應(yīng)結(jié)果。剩余PCR產(chǎn)物送至鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司測(cè)序。
[0056] 2. 6同源性比對(duì)分析：將測(cè)得的序列提交GenBank，采用BLAST的方式將測(cè)得的序 列與GenBank中公布的細(xì)菌16S rDNA序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析。
[0057] 2. 7細(xì)菌系統(tǒng)進(jìn)化分析：將測(cè)序結(jié)果和相關(guān)種屬代表菌株的16S rDNA部分序列用 DNAStar程序中的MegAlign軟件包進(jìn)行分析，通過(guò)Clustal V Method法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。 參考菌株如表1所示。
[0058] 表1參考菌株
[0059]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種防治肉雞呼吸道疾病的中藥益生菌復(fù)合制劑，其特征在于，由中藥提取液和益 生菌的菌粉復(fù)配而成； 所述中藥提取液的質(zhì)量濃度為0. 1-lg/mL，是由以下重量份的原料藥經(jīng)水煎煮制成 的： 烏梅14-18份、石榴皮10-14份、甘草6-10份、陳皮6-10份、厚樸6-10份、魚(yú)腥草2-6 份、連翹2-6份、茯苓2-6份； 所述益生菌為芽孢桿菌或乳酸菌的一種或兩種，該中藥益生菌復(fù)合制劑中每種益生菌 的活菌數(shù)均為 105cfu/mL_109cfu/mL。
2. 如權(quán)利要求1所述的一種防治肉雞呼吸道疾病的中藥益生菌復(fù)合制劑，其特征在 于，所述中藥提取液是由以下重量份的原料藥經(jīng)水煎煮制成的： 烏梅16份、石榴皮12份、甘草8份、陳皮8份、厚樸8份、魚(yú)腥草4份、連翹4份、茯苓 4份。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的一種防治肉雞呼吸道疾病的中藥益生菌復(fù)合制劑，其特征 在于，所述中藥提取液的質(zhì)量濃度為lg/mL。
4. 如權(quán)利要求1所述的一種防治肉雞呼吸道疾病的中藥益生菌復(fù)合制劑，其特征 在于，所述益生菌為保藏編號(hào)為CCTCCM2010260的枯草芽孢桿菌B7348和保藏編號(hào)為 CCTCCM2010150的植物乳桿菌LP。
5. 如權(quán)利要求4所述的一種防治肉雞呼吸道疾病的中藥益生菌復(fù)合制劑，其特征在 于，所述中藥益生菌復(fù)合制劑中每種益生菌的活菌數(shù)均為10 7cfu/mL。
6. -種防治肉雞呼吸道疾病的中藥益生菌復(fù)合制劑的制備方法，其特征在于，包括以 下步驟： (1) 中藥提取液的制備： 稱取烏梅14-18份、石榴皮10-14份、甘草6-10份、陳皮6-10份、厚樸6-10份、魚(yú)腥草 2-6份、連翹2-6份、茯苓2-6份，混合，向混合后的原料藥中加8-10倍體積的水，浸泡l-2h 后，煎煮l-2h，過(guò)濾，得初濾液；藥渣中加入4-6倍體積的水進(jìn)行復(fù)煎，煎煮30-60min，過(guò)濾， 得二級(jí)濾液；藥渣中再加入4-6倍體積的水進(jìn)行第二次復(fù)煎，煎煮30-60min，過(guò)濾，得三級(jí) 濾液，合并二、三級(jí)濾液，先低溫濃縮后再與初濾液混合，最終濃縮為質(zhì)量濃度為0. 1-lg/mL 的中藥提取液； (2) 向步驟（1)制備的中藥提取液加入益生菌的菌粉，混合，制備得到含每種益生菌的 活菌數(shù)均為105cfu/mL-109cfu/mL的中藥益生菌復(fù)合制劑。
7. 如權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，步驟（2)中，加入的益生菌為保藏編號(hào) 為CCTCCM2010260的枯草芽孢桿菌B7348和保藏編號(hào)為CCTCCM2010150的植物乳桿菌 LP0
8. 權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述的中藥益生菌復(fù)合制劑在制備預(yù)防和/或治療肉雞呼吸 道疾病的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種防治肉雞呼吸道疾病的中藥益生菌復(fù)合制劑，由中藥提取液和益生菌的菌粉復(fù)配而成，所述中藥提取液的質(zhì)量濃度為0.1-1g/mL，是由以下重量份的原料藥經(jīng)水煎煮制成的：烏梅14-18份、石榴皮10-14份、甘草6-10份、陳皮6-10份、厚樸6-10份、魚(yú)腥草2-6份、連翹2-6份、茯苓2-6份；所述益生菌為芽孢桿菌或乳酸菌的一種或兩種的混合，該中藥益生菌復(fù)合制劑中每種益生菌的活菌數(shù)均為105cfu/mL-109cfu/mL。本發(fā)明還公開(kāi)了該中藥益生菌復(fù)合制劑的制備方法。本發(fā)明的中藥益生菌復(fù)合制劑將中藥與益生菌合理配伍，其中，中藥可以促進(jìn)益生菌的增殖，益生菌可以促進(jìn)中藥的吸收和利用，中藥和益生菌的復(fù)合使用能夠起到更好的防治效果。
【IPC分類】A61P11-00, A61K35-744, A61K35-742, A61K36-78
【公開(kāi)號(hào)】CN104688895
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510089897
【發(fā)明人】單寶龍, 陳雷, 谷巍, 孫明杰, 張建梅, 王紅, 崔斌, 林顯華, 王軍, 王麗榮, 秦波, 王春鳳
【申請(qǐng)人】山東寶來(lái)利來(lái)生物工程股份有限公司
【公開(kāi)日】2015年6月10日
【申請(qǐng)日】2015年2月27日