r>[0036] 下面結(jié)合實施例，進一步闡述本發(fā)明：
[0037] 實施例1、獲取SVF
[0038] 1)抽取健康供者的脂肪組織50ml，靜置混有腫脹液的脂肪組織，待脂肪組織與腫 脹液自然分層。
[0039] 2)抽取脂肪組織20ml，加入30ml生理鹽水，400g離心10分鐘。
[0040] 3)取離心后的脂肪組織，用無菌剪刀剪碎，加入等體積的0. 125% I型膠原酶，封 口后，轉(zhuǎn)移至37°C恒溫氣浴搖床中，100R消化30min。
[0041] 4)酶解后的脂肪組織，800g離心10min ;離心后棄上兩層液體。
[0042] 5)用40mL生理鹽水重懸沉淀，合并從液體部分分離出來的細胞沉淀。800g離心 5min，棄去上清液（重復(fù)一次）。
[0043] 6)加入紅細胞裂解液，裂解15min，800g離心5min，棄去上清液。
[0044] 7)用生理鹽水重懸細胞沉淀，IOOum -次性濾網(wǎng)過濾細胞懸液至新的50mL離心管 中，800g 離心 5min。
[0045] 8)用4ml生理鹽水重懸細胞沉淀，吹打均勻，形成SVF細胞懸液。
[0046] 實施例2、獲取SVF
[0047] 1)抽取健康供者的脂肪組織70ml，靜置混有腫脹液的脂肪組織，待脂肪組織與腫 脹液自然分層。
[0048] 2)抽取脂肪組織30ml，加入20ml生理鹽水，400g離心10分鐘。
[0049] 3)取離心后的脂肪組織，用無菌剪刀剪碎，加入等體積的0. 125% I型膠原酶，封 口后，轉(zhuǎn)移至37°C恒溫氣浴搖床中，100R消化30min。
[0050] 4)酶解后的脂肪組織，800g離心10min ;離心后棄上兩層液體。
[0051] 5)用40mL生理鹽水重懸沉淀，合并從液體部分分離出來的細胞沉淀。800g離心 5min，棄去上清液（重復(fù)一次）。
[0052] 6)加入紅細胞裂解液，裂解15min，800g離心5min，棄去上清液。
[0053] 7)用生理鹽水重懸細胞沉淀，IOOum -次性濾網(wǎng)過濾細胞懸液至新的50mL離心管 中，800g 離心 5min。
[0054] 8)用Iml生理鹽水重懸細胞沉淀，吹打均勻，形成SVF細胞懸液。
[0055] 實施例3、SVF中主要細胞成分（間充質(zhì)干細胞、血管內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞） 的鑒定
[0056] 流式細胞儀檢測CD105、CD31、a-sma表達
[0057] 取實施例1、實施例2制備的SVF，調(diào)節(jié)密度成I X IO6的細胞懸液，分別取抗⑶105、 ⑶31、a-sma的單克隆抗體各5 yL，加入細胞懸液500 yL，室溫下避光孵育20min，為樣品 組；同時設(shè)立空白同型對照，1500r/min離心5min，棄上清，用含10% FBS的PBS洗滌2遍， 用500 y L PBS重懸后上機檢測。
[0058] 結(jié)果顯示：SVF中，間充質(zhì)干細胞表面抗原表達率為31. 9%，血管內(nèi)皮細胞表面抗 原表達率為2. 2 %，血管平滑肌細胞表面抗原表達率為1. 5 %。
[0059]1)間充質(zhì)干細胞檢測抗體（CD105)，如圖I (A)~圖I (D)所示。
[0060] 2)血管內(nèi)皮細胞檢測抗體（CD31)，如圖2⑷~圖2(D)所示。
[0061] 3)血管平滑肌細胞檢測抗體，如圖3 (A)~圖3 (D)所示。
[0062] 實施例4、獲取富含血小板血漿（PRP)
[0063] 1)獲取健康胎兒臍帶血40ml，添加枸櫞酸鈉抗凝劑4ml，轉(zhuǎn)移到50mL離心管中， 300g 離心 lOmin。
[0064] 2)離心結(jié)束后用巴氏吸管吸取上層血漿，轉(zhuǎn)移至50ml離心管中，1500g離心 IOmin 0
[0065] 3)吸棄離心后的部分血漿，使離心管底殘留4ml血漿。
[0066] 4)用巴氏吸管重懸血漿和底部的血小板，制成PRP。
[0067] 實施例5、獲取富含血小板血漿（PRP)
[0068] 1)獲取健康胎兒臍帶血70ml，添加枸櫞酸鈉抗凝劑8ml，轉(zhuǎn)移到50mL離心管中， 300g 離心 lOmin。
[0069] 2)離心結(jié)束后用巴氏吸管吸取上層血漿，轉(zhuǎn)移至50ml離心管中，1500g離心 IOmin 0
[0070] 3)吸棄離心后的部分血衆(zhòng)，使離心管底殘留Iml血漿。
[0071] 4)用巴氏吸管重懸血漿和底部的血小板，制成PRP。
[0072] 實施例6、PRP的鑒定
[0073] 取3ml已重懸的實施例4、實施例5制備的PRP，等份分成3份，使用Beckman C〇ulter-LH750型血細胞分析儀檢測血小板數(shù)量，在4h內(nèi)檢測完畢。結(jié)果見表1 :
[0074] 表1血小板數(shù)量檢測而結(jié)果
[0075]
【主權(quán)項】
1. 一種組合物，其特征在于，包括基質(zhì)血管組分和富含血小板血漿。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述基質(zhì)血管組分和富含血小板血漿 的質(zhì)量比為1:10~10:1。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的組合物，其特征在于，所述基質(zhì)血管組分包括間充質(zhì)干細 胞、血管內(nèi)皮細胞和血管平滑肌細胞。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項所述的組合物，其特征在于，所述基質(zhì)血管組分的制備方 法為：獲得脂肪組織，預(yù)處理后酶解。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的組合物，其特征在于，所述酶解采用I型膠原酶；所述I型膠 原酶的酶活為50~200IU/mg ;所述酶解為20~40°C酶解10~60min。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項所述的組合物，其特征在于，所述基質(zhì)血管組分中間充質(zhì) 干細胞表面抗原表達率為10~80 %，血管內(nèi)皮細胞表面抗原表達率為0. 1~10 %，血管平 滑肌細胞表面抗原表達率為〇. 1~10%。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1至6任一項所述的組合物，其特征在于，所述富含血小板血漿的制備 方法為：獲得臍帶血，離心，獲得富含血小板血漿。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1至7任一項所述的組合物，其特征在于，所述富含血小板血漿的制 備方法為：獲得臍帶血，與枸橡酸鈉抗凝劑混合，300g離心10min，收集血衆(zhòng)，1500g離心 IOmin ;收集離心管底部的血漿和血小板，重懸。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項所述的組合物，其特征在于，所述富含血小板血漿中血小 板數(shù)量為 340. 49 X IO6~432. 67 X 10 6。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1至9任一項所述的組合物在制備抗皺藥物或化妝品中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種組合物及其應(yīng)用。本發(fā)明將SVF、PRP二者聯(lián)合起來，應(yīng)用于皮膚抗皺，取得了更優(yōu)的抗皺效果，抗皺效果維持的時間比兩者單獨應(yīng)用的時間更長。從抗皺評分、抗皺時間來說，本發(fā)明提供的組合物與SVF、PRP兩者單獨使用均具有顯著差異(P＜0.05)。
【IPC分類】A61P17-00, A61K8-98, A61K35-35, A61K35-16, A61Q19-08
【公開號】CN104739862
【申請?zhí)枴緾N201510159337
【發(fā)明人】王一飛, 陳海佳, 葛嘯虎, 戴國勝, 王小燕
【申請人】廣州賽萊拉干細胞科技股份有限公司
【公開日】2015年7月1日
【申請日】2015年4月3日