一種多肽在制備治療或預(yù)防類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種多肽及其衍生物在制備治療和/或預(yù)防類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物 中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid arthritis，RA)是一種以慢性侵蝕性關(guān)節(jié)炎為特征的 全身性自身免疫病。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病變特點(diǎn)為滑膜炎，以及由此造成的關(guān)節(jié)軟骨和骨質(zhì) 破壞，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形。如果不經(jīng)過正規(guī)治療，約75%的患者在3年內(nèi)出現(xiàn)殘廢。類風(fēng)濕 關(guān)節(jié)炎分布于世界各地，在不同人群中的患病率為〇. 18%~1. 07%，其發(fā)病具有一定的種族 差異，印地安人高于白種人，白種人高于亞洲黃種人。在我國的總患病人數(shù)逾500萬。類風(fēng) 濕關(guān)節(jié)炎在各年齡中皆可發(fā)病，高峰年齡在30~50歲左右，一般女性發(fā)病多于男性。類風(fēng) 濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病原因尚不明確，一般認(rèn)為與遺傳、環(huán)境、感染等因素密切相關(guān)。
[0003] 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的主要病理改變?yōu)榛ぱ?，表現(xiàn)為滑膜增生和炎性細(xì)胞浸潤。類風(fēng) 濕關(guān)節(jié)炎的滑膜改變可分為炎癥期、血管翳形成期和纖維化期。血管翳形成是類風(fēng)濕關(guān)節(jié) 炎滑膜的重要病理特征，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎軟骨和骨破壞過程中發(fā)揮重要作用。關(guān)節(jié)外表現(xiàn) 的主要病理基礎(chǔ)為血管炎。類風(fēng)濕結(jié)節(jié)是其特征性表現(xiàn)，結(jié)節(jié)中心為類纖維素樣壞死組織， 周圍有"柵狀"排列的組織細(xì)胞，成纖維細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等。
[0004] 在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疾病中，炎癥由免疫系統(tǒng)細(xì)胞因子和響應(yīng)這些因子的T細(xì)胞介 導(dǎo)。目前的藥物治療主要采用：1)非留體類抗炎藥（NSAID)通過抑制環(huán)氧合酶（COX)活性， 減少前列腺素合成而具有抗炎、止痛、退熱及減輕關(guān)節(jié)腫脹；2)免疫抑制劑改善病情抗風(fēng)濕 藥（DMARDs)，如甲氨蝶呤等；3)生物制劑如腫瘤壞死因子（TNF) - a拮抗劑、白細(xì)胞介素 (IL) -1和IL-6拮抗劑、抗CD20單抗以及T細(xì)胞共刺激信號(hào)抑制劑，該類藥物是目前積極有 效控制炎癥的主要藥物，減少骨破壞，減少激素的用量和骨質(zhì)疏松，是開發(fā)治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié) 炎疾病藥物的熱點(diǎn)領(lǐng)域。
[0005]自噬是生物進(jìn)化過程中產(chǎn)生的一種細(xì)胞蛋白和細(xì)胞器的循環(huán)利用機(jī)制，參與多種 疾病如神經(jīng)退行性疾病、癌癥及心臟疾病等的病理過程。自噬過程廣泛存在于正常的生理 過程中，作為細(xì)胞對(duì)不良環(huán)境的一種防御機(jī)制，參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的異常蛋白和受損細(xì) 胞器的降解、炎癥和氧自由基的清除以維持正常細(xì)胞穩(wěn)態(tài)；但是自噬過度往往會(huì)導(dǎo)致胞內(nèi) 重要組分被降解，細(xì)胞發(fā)生死亡，因此自噬也被認(rèn)為是另一種形式的程序性細(xì)胞死亡。無論 是自噬過度還是自噬不足都可能導(dǎo)致疾病發(fā)生。最近研究表明自噬在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié) 損傷過程中發(fā)揮著重要作用，如在炎癥過程中出現(xiàn)的一些前炎性細(xì)胞因子包括白介素-1、 白介素-6,白介素-23以及TLR配體等促進(jìn)自噬的發(fā)生。同時(shí)自噬也控制炎性細(xì)胞因子的 釋放，調(diào)控著與自身免疫性疾病有牽連的細(xì)胞。自噬可能是新的抗炎療法作用靶標(biāo)。
[0006] TRB3 (Tribbles Homologue3)是Tribbles同源蛋白家族成員之一，最早在果蠅中 被鑒定到，并發(fā)現(xiàn)該蛋白能抑制有絲分裂，調(diào)節(jié)發(fā)育過程中細(xì)胞的增殖、遷移及形態(tài)形成。 在哺乳動(dòng)物中，有三種Tribbles同源蛋白：TRB1，TRB2和TRB3,它們都是假激酶蛋白家族 成員。這三種蛋白都含有Ser/Thr蛋白激酶樣結(jié)構(gòu)域（Kinaselikedomain,KD)，但卻缺乏ATP的結(jié)合位點(diǎn)和催化殘基，因此沒有激酶活性。盡管如此，Tribbles蛋白卻具有接頭蛋 白樣的功能，參與多種蛋白復(fù)合體的組裝。在哺乳動(dòng)物Tribbles家族成員中，TRB3的研究 最為深入，其相互作用蛋白包括轉(zhuǎn)錄因子、泛素連接酶、細(xì)胞膜上II型BMP受體以及MAPK、 PI3K信號(hào)通路成員。通過與這些蛋白相互作用，TRB3參與了糖脂代謝、脂肪細(xì)胞分化、凋 亡、應(yīng)激和膠原表達(dá)等的調(diào)控。
[0007] 近來研究證據(jù)表明，TRB3在關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展過程中都具有重要的調(diào)節(jié)作用，在 正常的人軟骨細(xì)胞可以檢測到TRB3信使RNA。TRB3蛋白水平低，在正常軟骨細(xì)胞中TRB3 低表達(dá)而在關(guān)節(jié)炎的軟骨中高表達(dá)。過表達(dá)TRB3可以抑制Akt磷酸化，減少軟骨細(xì)胞的生 存和蛋白多糖的合成。Tang等人發(fā)現(xiàn)終末糖基化產(chǎn)物（AGEs)激活TRB3/MAPK信號(hào)通路介 導(dǎo)的I型和III型膠原表達(dá)。Cravero等人發(fā)現(xiàn)TRB3可以抑制Akt活性，TRB3高表達(dá)將促 進(jìn)細(xì)胞死亡以及減少軟骨細(xì)胞對(duì)胰島素樣生長因子I (IGF-I)的反應(yīng)。因此，研究和開發(fā) TRB3蛋白的抑制劑，或者阻斷其與P62蛋白結(jié)合的物質(zhì)，將為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的臨床治療 提供有效且嶄新的手段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對(duì)目前缺乏能有效利用的TRB3蛋白抑制劑的現(xiàn) 狀，而提供一種能特異性結(jié)合TRB3的多肽及其在制備預(yù)防和/或治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥 物中的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明的發(fā)明人在研究的過程中發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞內(nèi)TRB3的過度表達(dá)能降低自噬 關(guān)鍵性抑制因子mTOR蛋白水平，并抑制多個(gè)自噬相關(guān)蛋白，例如II型LC3、Becline-1、 PI3K3C表達(dá)增多，進(jìn)而造成自噬相關(guān)貨車蛋白P62產(chǎn)生堆積，證明腫瘤細(xì)胞內(nèi)TRB3表達(dá) 能誘導(dǎo)自噬受到抑制。P62是反映自噬動(dòng)態(tài)過程的重要指標(biāo)，作為"貨車蛋白"，P62蛋 白結(jié)構(gòu)域中的泛素相關(guān)結(jié)構(gòu)域（Ubiquitinassociateddomain，UBA)能與泛素化蛋白 (Ubiquitin，Ub)結(jié)合，并把它們募集到自噬體膜上與LC3結(jié)合，這個(gè)過程主要通過P62蛋 白的LIR(LC3-InteractingRegion，LIR)結(jié)構(gòu)域與LC3結(jié)合，介導(dǎo)泛素化蛋白的降解，P62 的表達(dá)水平也隨之降低。自噬受到抑制時(shí)，P62與其結(jié)合的泛素化蛋白不能及時(shí)降解，在胞 漿內(nèi)堆積而表達(dá)升高。發(fā)明人還進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)的TRB3主要與P62蛋白發(fā)生相互 作用，進(jìn)而阻斷其他泛素化蛋白與P62蛋白的結(jié)合，造成自噬通路被抑制，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的 發(fā)生和轉(zhuǎn)移?；诎l(fā)明人的研究工作，本發(fā)明提供下述技術(shù)方案。
[0010] 本發(fā)明提供的技術(shù)方案是：一種可特異性結(jié)合TRB3的多肽或所述多肽的衍生物 在制備預(yù)防和/或治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物中的應(yīng)用；
[0011] 所述的多肽的氨基酸序列為如SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3所示 序列中的任一種；
[0012] 所述多肽的衍生物為所述多肽與細(xì)胞穿膜肽接連所形成的嵌合肽。
[0013] 本發(fā)明中，所述的如SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3所示的氨基酸 序列中，可適當(dāng)引入氨基酸替換，缺失或添加，只要改變后的氨基酸序列仍然能夠形成能與 TRB3特異性結(jié)合的多肽且該多肽仍然保持改變前的活性即可。
[0014] 本發(fā)明中，所述的細(xì)胞穿膜肽為本領(lǐng)域常規(guī)所述的細(xì)胞穿膜肽，只要其能輔助將 所述多肽送入細(xì)胞以發(fā)揮作用即可，一般而言，所述的細(xì)胞穿膜肽為由10~30個(gè)氨基酸組 成的短肽分子。所述的細(xì)胞穿膜肽較佳地為P印2多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO :4所示； 即在本發(fā)明中，所述的多肽衍生物較佳地為以P印2多肽連接如SEQ ID NO :1、SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO :3所示序列中的任一種多肽后所形成的嵌合多肽。所述的細(xì)胞穿膜肽還可 以為HIV-I病毒反轉(zhuǎn)錄激活因子（Trans-activator transcription, Tat)蛋白的TAT肽 (YGRKKRRQRRR，其氨基酸序列如SEQ ID :5所示)、果蠅觸角同源異型蛋白的轉(zhuǎn)錄因子Antp 肽（RQIKIWFQNRRMKWKK，其氨基酸序列如 SEQ ID :6 所示）、P印-1 肽（KETffffETffffTEWSQPKKK RKV，其氨基酸序列如 SEQ ID :7 所示)、MPG 肽（GALFLGFLGAAGS TMGAWSQPKSKRKV，其氨基酸 序列如SEQ ID :8所示)和R⑶肽（Ar g-Gly-Asp，其氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示）中的 任一種或多種。所述細(xì)胞穿膜肽較佳地連接在所述多肽的N端或者C端，更佳的是N端。
[0015] 本發(fā)明所述的多肽及其衍生物可以作為活性成分用于制備預(yù)防或治療類風(fēng)濕性 關(guān)節(jié)炎的藥物。所述的"活性成分"是指具有預(yù)防和/或治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎功能的化合 物，即所述多肽或所述多肽的衍生物用于制備預(yù)防和/或治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物。在 該藥物中，所述多肽或所述多肽的衍生物可以單獨(dú)作為活性成分，也可以和其他化合物一 起作為活性成分。
[0016] 本發(fā)明中，所述的藥物可以包含生理學(xué)或藥學(xué)上可接受的載體，所述的載體可以 為任意合適的生理學(xué)或藥學(xué)上可接受的藥物輔料，較佳地選自殼聚糖及其衍生物、卡波姆 和脂質(zhì)體中的一種或多種。因此，在本發(fā)明中，所述的多肽或所述多肽的衍生物較佳地與所 述藥物輔料組成藥物組合物。所述的藥物組合物可以為本領(lǐng)域常規(guī)所述的各種劑型，較佳 地是固體、半固體或液體的形式，可以是水溶液、非水溶液或混懸液，更佳地是片劑、膠囊、 顆粒劑、注射劑或輸注劑等。所述藥物組合物的給藥途徑較佳地為注射給藥或口服給藥，所 述注射給藥較佳地包括：靜脈注射、肌肉注射、腹腔注射、皮內(nèi)注射或皮下注射途徑給藥。
[0017] 本發(fā)明所述的藥物組合物在治療時(shí)的使用劑量根據(jù)患者的年齡和病情而定，使用 劑量較佳地為0. 1~15mg/kg，更佳地為5~10mg/kg，最優(yōu)選為5mg/kg，給藥次數(shù)較佳地為 一天一次或數(shù)次。
[0018] 本發(fā)明中，所述的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎能夠引發(fā)多種病癥，本發(fā)明所述的多肽或所述 多肽的衍生物能夠針對(duì)性地治療該些病癥，所述病癥可以為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎引起的滑膜 炎，滑膜炎主要表現(xiàn)為滑膜增生和炎性細(xì)胞浸潤，或者可以為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎引起的足趾 腫脹，或者可以為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎引起的血管炎，或者可以為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎引起的纖維 組織增生。
[0019] 在預(yù)防或治療糖尿病性心肌病時(shí)，本發(fā)明所述的藥物組合物可以單獨(dú)使用或者和 其他藥物聯(lián)合使用。
[0020] 在符合本領(lǐng)域常識(shí)的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實(shí) 例。
[0021] 本發(fā)明所用試劑和原料除特別說明之外，均市售可得。