[0022] 本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于：
[0023]目前臨床上治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎一般采用非甾類抗炎藥（NSAIDs)、抗風(fēng)濕藥 (DMARDs)或者生物制劑。非留類抗炎藥主要通過抑制環(huán)氧合酶（COX)活性，減少前列腺 素合成而具有抗炎、止痛、退熱及減輕關(guān)節(jié)腫脹的作用，但其存在一定的不良反應(yīng)，包括 胃腸道癥狀、肝和腎功能損害以及可能增加的心血管不良反應(yīng)。而改善病情的抗風(fēng)濕藥 (DMRDs)較非甾類抗炎藥發(fā)揮作用慢，大約需要1~6個月，且副作用較大，常對肝、腎及 造血系統(tǒng)造成損害。另外，目前治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的生物制劑主要包括腫瘤壞死因子 (TNF)-a拮抗劑、白細(xì)胞介素（IL)-I和IL-6拮抗劑、抗CD20單抗以及T細(xì)胞共刺激信號抑 制劑等，雖然這類生物制劑靶向性強，但其強大的免疫抑制作用，仍會帶來一些不良反應(yīng)。
[0024] 而本發(fā)明所述的多肽或多肽衍生物能夠特意性地與細(xì)胞內(nèi)的TRB3結(jié)合，從而阻 斷TRB3與P62蛋白的相互作用，溫和地激活自噬，有效改善在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程中 免疫細(xì)胞由于自身自噬阻斷而造成的炎癥反應(yīng)。同時，該肽段的衍生物P印2-Al，P印2-A2， P印2-A3可以改善人工誘導(dǎo)的動物關(guān)節(jié)炎癥，不再出現(xiàn)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎癥狀。
【附圖說明】
[0025] 圖1為免疫共沉淀方法驗證P62蛋白與TRB3蛋白之間存在相互作用。
[0026] 圖2為實施例3中，正常組、模型組、MTX組、高劑量多肽組治療CIA大鼠5周后足 趾腫脹及踝關(guān)節(jié)病理切片照片。其中，A和F為正常組，HEXlOO ;B和G為模型組，HEXlOO; C和H為MTX治療組，HEX 100 ;D和I為高劑量多月太治療組，HEX 100。
【具體實施方式】
[0027] 下面通過實施例的方式進(jìn)一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實 施例范圍之中。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商 品說明書選擇。
[0028] 下述實施例中，部分物質(zhì)的全稱或相應(yīng)的中文名稱如下：
[0029] MTX:甲氨喋呤；
[0030] CIA:膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎；
[0031] KHB:Krebs_Henseleit緩沖液；
[0032] Laminin:層粘連蛋白；
[0033] HEPES:羥乙基哌嗪乙硫磺酸；
[0034] BSA:牛血清白蛋白；
[0035] EDTA:乙二胺四乙酸；
[0036] NP40:乙基苯基聚乙二醇；
[0037] TBST:含吐溫-20的Tris緩沖液；
[0038] PBS:pH7.4的磷酸緩沖液
[0039] Leu(Leupeptin，亮肽素）、Pep(Pepstatin，胃酶抑素）、Apr(Aprotinin，胰蛋白 酶抑制劑)、DTT(Dithiothreitol，二硫蘇糖醇）：均為蛋白酶抑制劑。
[0040] 下述實施例中，序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3所示的多肽分 別稱為Al、A2和A3,其連接P印2細(xì)胞穿膜肽（P印2的氨基酸序列為HLYVSPW，如序列表中 SEQ ID N0:4所示）后形成的嵌合多肽分別稱為P印2-Al、P印2-A2和P印2-A3,上述多肽或 嵌合肽均由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司人工合成。AU A2和A3通過兩個谷氨酸鏈連接 到P印2的C端。以上嵌合肽的序列結(jié)構(gòu)如下：
[0041] P印2-A1序列為：
[0042] -His-Leu-Tyr-Val-Ser-Pro-Trp-Gly-Gly-Ser-Leu-Ser-Gln-Met-Leu-Ser-M et- "C"（其序列如序列表中SEQ ID NO: 10所示)。
[0043] P印2-A2的序列為：
[0044] -His-Leu-Tyr-Val-Ser-Pro-Trp-Gly-Gly-Gly-Gly-Trp-Leu-Thr-Arg-Leu-L eu-Gln-Thr-Lys- "C"（其序列如序列表中 SEQ ID N0:11 所不）。
[0045] P印2-A3的序列為：
[0046] "N" -His-Leu-Tyr-Val-Ser-Pro-Trp-Gly-Gly-Ile-Gly-Ala-Ala-Leu-Asp-Thr-I I e- "C"（其序列如序列表中SEQ ID NO: 12所示)。
[0047] 下述實施例中所述室溫如本領(lǐng)域常規(guī)所述，一般指15~25°C。
[0048] 實施例1類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎體外模型制備
[0049] I. 1模型構(gòu)建
[0050] 1)收集類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者膝蓋或手腕滑膜切除術(shù)或關(guān)節(jié)置換術(shù)中獲得滑膜或 骨樣本。
[0051] 2)無菌條件下，樣本被切成2立方毫米小塊并分成數(shù)份置于2塊24孔板中。
[0052] 3)樣本利用 MEM(Gibco, Grand Island, NY, USA)完全培養(yǎng)基(含有 2mM L-谷氨酰 胺、lOOU/ml青霉素、50mg/ml慶大霉素、20mM N-2-羥乙基哌嗪-N' -2-乙基磺酸緩沖溶液和 1%胎牛血清）每孔2mL，37°C，5%C02,95%濕度培養(yǎng)過夜。
[0053] 4)剪碎的組織塊在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待組織塊內(nèi)的炎性細(xì)胞及其他細(xì)胞進(jìn)入培養(yǎng)基 中，作為次日藥物治療實驗的工具細(xì)胞。
[0054] 1. 2治療活性檢測
[0055] 1)按照I. 1制備類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎體外模型，分成多肽處理組及未處理對照組，每 組6個復(fù)孔。
[0056] 2)多肽處理組中使用P印2-A1，P印2-A2, P印2-A3處理滑膜或骨骼培養(yǎng)物，將 P印2-A1，P印2-A2和P印2-A3多肽干粉用生理鹽水溶解，直接加入到培養(yǎng)孔中，經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng) 基稀釋至終濃度為50M，未處理組加等體積生理鹽水，培養(yǎng)24h。
[0057] 3) 24h后收集各孔細(xì)胞培養(yǎng)上清，使用商業(yè)化細(xì)胞因子檢測試劑盒(請給出型號） (包括人IL6定量ELISA檢測試劑盒D6050、人IL-Ibeta定量ELISA檢測試劑盒DLB50和人 TNF-alpha定量ELISA檢測試劑盒DTA00C，均購自R&D System公司），按照試劑盒說明書進(jìn) 行操作，雙夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測培養(yǎng)液中IL-I P、IL-6、TNF-a等含量。
[0058] 1. 3統(tǒng)計學(xué)處理
[0059] 數(shù)據(jù)用X±SD表示，t檢驗統(tǒng)計分析各組差異顯著性，由SPSS13. 0統(tǒng)計軟件分析。
[0060] 1. 4 結(jié)果
[0061] P印2-A1，P印2-A2, P印2-A3與未處理組相比較，P印2-A1，P印2-A2, P印2-A3可以 改善風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)因子，見表1。
[0062] 與未處理組相比較，三種多肽治療組的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)細(xì)胞因子TNF-a、 IL-6及IL-I P均有明顯下降，其中p印2-A2組在三組多肽組中效果最優(yōu)。
[0063] 表1.比較三種多肽對風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)細(xì)胞因子的影響（n=6, X土SD)
[0064]
【主權(quán)項】
1. 一種可特異性結(jié)合TRB3的多肽或所述多肽的衍生物在制備治療和/或預(yù)防類風(fēng)濕 性關(guān)節(jié)炎的藥物中的應(yīng)用； 所述的多肽的氨基酸序列為如SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3所示序列 中的任一種； 所述多肽的衍生物為所述多肽與細(xì)胞穿膜肽接連所形成的嵌合肽。
2. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述細(xì)胞穿膜肽的氨基酸序列如序列表中 SEQ ID N0:4~SEQ ID N0:9中的任一種所示。
3. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述嵌合肽為如序列表中SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3所示序列中的任一種的多肽的N端與細(xì)胞穿膜肽連接。
4. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述嵌合肽為如序列表中SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3所示序列中的任一種的多肽的C端與細(xì)胞穿膜肽連接。
5. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述可特異性結(jié)合TRB3的多肽或所述多肽 的衍生物作為單一活性成分在制備治療和/或預(yù)防類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物中的應(yīng)用。
6. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述可特異性結(jié)合TRB3的多肽或所述多肽 的衍生物與其他治療和/或預(yù)防類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物聯(lián)合作為活性成分在制備治療和/ 或預(yù)防類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物中的應(yīng)用。
7. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 引起的滑膜炎。
8. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 引起的炎癥細(xì)胞浸潤。
9. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 引起的足趾腫脹。
10. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 引起的纖維組織增生。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種可特異性結(jié)合TRB3的多肽或所述多肽的衍生物在制備治療和/或預(yù)防類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物中的應(yīng)用；所述的多肽的氨基酸序列為如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示序列中的任一種；所述多肽的衍生物為所述多肽與細(xì)胞穿膜肽接連所形成的嵌合肽。本發(fā)明的多肽或多肽衍生物能夠特異性地與TRB3結(jié)合，從而阻斷TRB3與P62蛋白的相互作用，該肽段的衍生物Pep2-A1，Pep2-A2，Pep2-A3可以治療或預(yù)防類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎引發(fā)的各類病癥。
【IPC分類】A61K38-08, A61K47-48, A61P29-00, A61K45-00, A61P19-02
【公開號】CN104740603
【申請?zhí)枴緾N201310729055
【發(fā)明人】胡卓偉, 花芳, 孫巍
【申請人】胡卓偉
【公開日】2015年7月1日
【申請日】2013年12月25日