多價(jià)肺炎球菌多糖-蛋白質(zhì)結(jié)合物組合物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及多價(jià)免疫原性組合物，包含：通過將源自肺炎鏈球菌血清型1、2、3、4、 5、6A、6B、7F、9N、9V、14、18C、19A、19F和23F的莢膜多糖（capsularpolysaccharide)結(jié)合 至載體蛋白如CRM197制備的15種不同的多糖-蛋白質(zhì)結(jié)合物（綴合物，conjugate)。本發(fā) 明總體上涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，并且具體涉及微生物學(xué)、免疫學(xué)、疫苗以及通過免疫預(yù)防嬰兒、兒 童和成人中的肺炎球菌疾病。
【背景技術(shù)】
[0002] 肺炎鏈球菌（Streptococcuspneumoniae)是肺炎的主要原因。根據(jù)國家統(tǒng)計(jì)局 公布的2010死亡趨勢(shì)原因，肺炎是10大死亡原因之一，每100, 000人中有14. 9人死亡，比 2000年增加82. 9%。世界衛(wèi)生組織（WHO)還估算了在2012年，全球小于5歲的476, 000例 HIV陰性兒童死于肺炎鏈球菌感染，對(duì)于小于5歲的兒童，其占各種原因死亡兒童的5%。
[0003] 在1977年，RobertAustrian博士研制出14價(jià)肺炎球菌多糖疫苗來預(yù)防肺炎球 菌疾病，之后該疫苗發(fā)展至23價(jià)多糖疫苗。已經(jīng)證明多價(jià)肺炎球菌多糖疫苗對(duì)于預(yù)防中老 年人和高危患者中的肺炎球菌疾病是有用的。然而，由于T細(xì)胞獨(dú)立的免疫應(yīng)答，所以嬰兒 和幼兒對(duì)大多數(shù)的肺炎球菌多糖應(yīng)答很差。7價(jià)肺炎球菌結(jié)合疫苗（7vPnC，Prevnar?:)包 含來自7種最普遍的血清型4、68、聽、14、18(：、19?和23?的莢膜多糖。自從2000年在美國 獲得批準(zhǔn)，已經(jīng)證實(shí)Prevnar是高度免疫原性的并且有效抵抗嬰兒和幼兒中的侵襲性疾病 和中耳炎?，F(xiàn)在，該疫苗在全世界約80個(gè)國家獲得批準(zhǔn)。Prevnar分別在美國、歐洲和世界 的其他地區(qū)覆蓋了大約80-90 %、60-80 %和40-80 %的侵襲性肺炎球菌疾?。↖ro)。正如預(yù) 期的，在引入Prevnar后的幾年中收集的監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)已經(jīng)清楚地證實(shí)，在美國由被Prevnar覆 蓋的血清型引起的侵襲性肺炎球菌疾病降低。然而，血清型的覆蓋率限于一些地區(qū)，并且由 沒有被Prevnar覆蓋的血清型（特別是19A)引起的侵襲性肺炎球菌疾病增加。
[0004]咨詢委員會(huì)的免疫實(shí)踐（TheAdvisoryCommitteeonImmunizationPractices， ACIP)在2010年2月公布了對(duì)于用于接種新批準(zhǔn)的13價(jià)肺炎球菌結(jié)合疫苗（PCV-13)的建 議。PCV-13是包含除包含在Prevnar中的7種血清型（4、6B、9V、14、18C、19F、23F)之外的 6種另外的血清型（1、3、5、6A、7F、19A)的肺炎球菌結(jié)合疫苗。根據(jù)美國活性細(xì)菌核心監(jiān)測(cè) (ActiveBacterialCoresurveillance，ABCs)，在已知為小于5歲的兒童中的致病血清型 的IPD病例中的總共64%被PCV-13覆蓋。在2007年，在小于5歲的兒童的4600例IPD中 的僅70病例被PCV7覆蓋，而2900病例被PCV-13覆蓋，其占主要部分。現(xiàn)在，正在研制15 價(jià)肺炎球菌結(jié)合疫苗，其覆蓋發(fā)病率隨血清型替換而增加的另外的血清型。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 因此，本發(fā)明提供了用于預(yù)防嬰兒、兒童和成人的肺炎球菌疾病的多價(jià)免疫原性 組合物，該多價(jià)免疫原性組合物包含源自15種肺炎球菌血清型、包括血清型2和9N的莢膜 多糖。
[0006]具體地，本發(fā)明提供 了包含血清型 1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9N、9V、14、18C、19A、19F 和23F的15價(jià)肺炎球菌結(jié)合物（PCV-15)組合物。
[0007] 技術(shù)方案
[0008] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了多價(jià)免疫原性組合物，其包含15種不同的多 糖-蛋白質(zhì)結(jié)合物和生理用載體，其中，每種結(jié)合物包含源自結(jié)合至載體蛋白的肺炎鏈球 菌的不同血清型的莢膜多糖，并且莢膜多糖由血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9N、9V、14、18C、 19A、19F和 23F制備。
[0009] 在根據(jù)本發(fā)明的多價(jià)免疫原性組合物中，載體蛋白可以是CRM197。根據(jù)本 發(fā)明的多價(jià)免疫原性組合物可以進(jìn)一步包含佐劑，例如，包含鋁類（鋁基，基于鋁的， aluminum-based)佐劑的佐劑。佐劑可以選自由磷酸錯(cuò)、硫酸錯(cuò)和氫氧化錯(cuò)組成的組，并且 優(yōu)選的是磷酸鋁。
[0010] 根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步方面，提供了用于誘導(dǎo)對(duì)肺炎鏈球菌莢膜多糖結(jié)合物的免疫 應(yīng)答的藥物組合物，該藥物組合物包含免疫學(xué)有效量的所述免疫原性組合物。
[0011] 在一個(gè)實(shí)施方式中，藥物組合物可以是被配制為包含以下的免疫原性組合物：除 了在4yg的6B，2yg的每種糖；大約34ygCRM197載體蛋白；0? 125mg元素錯(cuò)（0? 5mg磷酸 鋁）佐劑；和作為賦形劑的氯化鈉和琥珀酸鈉緩沖液。
[0012] 技術(shù)效果
[0013] 多價(jià)免疫原性組合物包含源自15種不同的肺炎球菌血清型（包括血清型2和9N) 的莢膜多糖，從而導(dǎo)致升高的血清IgG效價(jià)（滴度，titer)和功能性抗體活性。因此，可以 將該多價(jià)免疫原性組合物有利地用于預(yù)防嬰兒、兒童和成人中的肺炎球菌疾病。
【附圖說明】
[0014] 圖1至圖15示出了在二次注射本發(fā)明的和比較例（Prevnar7和Prevnar13)的 疫苗組合物3周后（即，總共6周），測(cè)得的血清型特異性IgG的水平。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 發(fā)明模式
[0016] 已經(jīng)通過具有抗生素抗性和多重抗藥性的一些血清型進(jìn)行了血清型替 換。血清型分布的地區(qū)差異導(dǎo)致地區(qū)覆蓋Prevnar的差異。（HarboeZB,Benfield TL,Valentiner-BranthP，etal.TemporalTrendsinInvasivePneumococcalDisease andPneumococcalSerotypesover7Decades.ClinInfectDis2010;50:329-37)。因 此，沒有理由除去現(xiàn)有的肺炎球菌結(jié)合疫苗中的任何血清型。相反，需要通過添加血清型進(jìn) 一步擴(kuò)大覆蓋率。
[0017]在2008年，全球肺炎球菌血清型項(xiàng)目（PneumococcalGlobalSerotypeProject， GSP)發(fā)布了基于選擇的1980年至2007年的iro數(shù)據(jù)的報(bào)道，示出繼血清型18C之后，血清 型2是前20個(gè)全球血清型中第11個(gè)最高發(fā)病率的血清型。此外，SamirK.Saha等人報(bào)道 血清型2可能成為威脅，因?yàn)檠逍?具有在孟加拉國引起肺炎球菌性腦膜炎的高可能性， 但是沒有被包含在任何肺炎球菌結(jié)合疫苗中（SahaSK，AlEmranHM，HossainB，Darmstadt GLjSahaS,etal. (2012)StreptococcuspneumoniaeSerotype-2ChildhoodMeningitis inBangladesh:ANewlyRecognizedPneumococcalInfectionThreat.PLoSONE2012 ； 7 (3) :e32134)。因此，如果包含血清型2,則可以降低肺炎球菌疾病的數(shù)量，并且可以進(jìn)一步 為接種PCV-13可能發(fā)生的血清型替換做準(zhǔn)備。
[0018] 肺炎球菌血清型示出不同的年齡分布格局。具體地，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，與24個(gè)月至59個(gè) 月大的兒童相比，血清型9N對(duì)0個(gè)月至23個(gè)月大的嬰兒相對(duì)重要。血清型9N是繼包含在PCV-13中的13血清型之后第14個(gè)最常見的。這表明包含血清型9N將有助于減少特別是 嬰兒中的肺炎球菌疾病。
[0019] 本發(fā)明提供了包含源自15種肺炎球菌血清型（包括血清型2和9N)的莢膜多糖的 多價(jià)免疫原性組合物。具體地，本發(fā)明提供了包含以下的多價(jià)免疫原性組合物：15種不同 的多糖_蛋白質(zhì)結(jié)合物和生理用載體，其中，每種結(jié)合物包含來自結(jié)合至載體蛋白的肺炎 鏈球菌的不同血清型的莢膜多糖，并且該莢膜多糖由血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9N、9V、 14、18C、19A、19F和 23F制備。
[0020] 莢膜多糖可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備。為了減少活化的莢膜多糖 的粘度或增加其溶解度，可以降低莢膜多糖的大小。在本發(fā)明中，由肺炎鏈球菌的血清型1、 2、3、4、5、6A、6B、7F、9N、9V、14、18C、19A、19F和23F制備莢膜多糖。通過分離方法制備這些 肺炎球菌結(jié)合物，并且將其配制成單劑量的制劑。例如，使每種肺炎球菌多糖血清型在大豆 基（基于大豆的，soy-based)培養(yǎng)基中生長，然后通過離心、沉淀、和超過濾純化。
[0021] 載體蛋白優(yōu)選的是無毒的和非反應(yīng)原性的并且可得到充足量和純度的蛋白。載 體蛋白應(yīng)當(dāng)可進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合程序。在本發(fā)明的多價(jià)免疫原性組合物中，載體蛋白可以是CRM197。CRM197是從生長在基于酪蛋白氨基酸（casaminoacid)和酵母提取物的培養(yǎng)基上的 棒狀桿菌白喉菌株C7 (M97)的培養(yǎng)物分離的白喉毒素的無毒變體（S卩，類毒素）。通過超 過濾、硫化銨沉淀和離子交換色譜法純化CRM197?？商娲?，根據(jù)美國專利號(hào)5, 614, 382重 組制備CRM197。
[0022] 其他白喉毒素也適于用作載體蛋白。其他合適的載體蛋白包括滅活的細(xì)菌毒素如 破傷風(fēng)類毒素、百日咳類毒素；霍亂類毒素（W02004/083251);大腸桿菌（E.coli)