一種體外構(gòu)建具有抗流動剪切力和抗血小板凝集功能的血管內(nèi)皮層的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)、組織工程領(lǐng)域，更具體地涉及一種體外構(gòu)建具有抗生理大小的流動剪切力和抗血小板凝集功能的血管內(nèi)皮層的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]用組織工程方法體外構(gòu)建小口徑人造血管植入物是解決臨床上小口徑血管移植物來源不足的重要途徑。但是目前小口徑人造血管還不能應(yīng)用于臨床，一個重要原因是小口徑人造血管移植后容易發(fā)生血小板凝集導(dǎo)致的急性血栓和遠(yuǎn)期的移植部位的再狹窄，這些問題都是由于小口徑血管移植物內(nèi)表面缺乏完整的、有功能的內(nèi)皮細(xì)胞層造成的。
[0003]體內(nèi)的完整的血管內(nèi)皮細(xì)胞層具有抗血小板凝集、抗炎癥、抗動脈硬化的功能，對于維持血管的正常生理功能有重要作用。為此小口徑人造血管構(gòu)建過程中采用了多種方法提高內(nèi)皮細(xì)胞在人造血管內(nèi)表面的留存。Schneider等通過在人造血管內(nèi)表面培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞的方法構(gòu)建具有完整內(nèi)皮細(xì)胞層的小口徑人造血管，但是體外靜態(tài)培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞不能耐受體內(nèi)水平的流動剪切力，在移植到體內(nèi)I小時之內(nèi)，15-85%的內(nèi)皮細(xì)胞被血流沖走(Schneider, P., Hanson, S.&Price, T.1988.Durability ofconfluent endothelial cell monolayers on small calibre vascular prosthesesin vitro Surgery 103，456-462.)。Ott等通過對體外培養(yǎng)在血管支架上的內(nèi)皮細(xì)胞施加流動剪切力，首先在l_2dyn/cm2的流動剪切力作用下誘導(dǎo)3天，再在25dyn/cm2的流動剪切力作用下誘導(dǎo)3天，最終發(fā)現(xiàn)剪切力誘導(dǎo)提高了血管內(nèi)皮細(xì)胞的剪切力耐受會K 力(Ott, M.J., Olson, J.L.&Ballermann, B.J.1995.Chronic in vitro fow promotesultrastructural differentiat1n of endothelial cells.Endothelium 3，21-30)，但是Ott等施加在內(nèi)皮細(xì)胞上的誘導(dǎo)剪切力變化過于劇烈，可能會損傷內(nèi)皮細(xì)胞的正常功能。誘導(dǎo)剪切力變化過于劇烈是目前以剪切力誘導(dǎo)方式提高內(nèi)皮細(xì)胞剪切力耐受能力的工作中存在的共性問題，因為血管內(nèi)皮細(xì)胞對剪切力的變化非常敏感，Tsou等發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞能夠感受到0.25dyn/cm2的剪切力變化，從而改變基因表達(dá)(Tsou，J.K.et al.2008.Spatial regulat1n of inflammat1n by human aortic endothelial cells in alinear gradient of shear stress.Microcirculat1n 15，311-323)，因此劇烈的剪切力變化可能會損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞的正常功能。
[0004]綜上所述，采用逐漸地、緩慢地增加剪切力的方式誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞，提高血管內(nèi)皮細(xì)胞抗流動剪切力的能力，是體外構(gòu)建具有抗流動剪切力和抗血小板凝集功能的血管內(nèi)皮層的有效方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種簡單、快速、能夠體外構(gòu)建具有抗流動剪切力和抗血小板凝集功能的血管內(nèi)皮層的方法。
[0006]采用本發(fā)明所述的體外構(gòu)建具有抗流動剪切力和抗血小板凝集功能的血管內(nèi)皮層的方法能夠?qū)θ嗽煅軆?nèi)腔表面的血管內(nèi)皮細(xì)胞緩慢地，逐漸增加的施加流動剪切力，使內(nèi)皮細(xì)胞處于不斷緩慢增加的流動剪切力環(huán)境中，從而給予血管內(nèi)皮細(xì)胞充分的時間適應(yīng)剪切力，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞改變形態(tài)、細(xì)胞骨架和細(xì)胞外基質(zhì)排列和其它功能，最終使內(nèi)皮細(xì)胞耐受生理水平的流動剪切力，保持血管內(nèi)皮層的完整，使血管內(nèi)皮層具有抗血小板凝集的正常生理功能。采用本發(fā)明所述的體外構(gòu)建具有抗流動剪切力和抗血小板凝集功能的血管內(nèi)皮層的方法，在人造血管內(nèi)腔的內(nèi)皮細(xì)胞受到的剪切力達(dá)到移植動脈部位的動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞所承受的平均剪切力或剪切力峰值水平后，能夠?qū)θ嗽煅軆?nèi)腔表面的血管內(nèi)皮細(xì)胞加載移植動脈部位的平均流動剪切力24-72小時，使血管內(nèi)皮細(xì)胞有充分的時間適應(yīng)生理水平的流動剪切力。
[0007]采用本發(fā)明所述的體外構(gòu)建具有抗流動剪切力和抗血小板凝集功能的血管內(nèi)皮層的方法，在人造血管內(nèi)腔的內(nèi)皮細(xì)胞受到的剪切力達(dá)到移植動脈部位的動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞所承受的平均剪切力或剪切力峰值水平后，能夠?qū)θ嗽煅軆?nèi)腔表面的血管內(nèi)皮細(xì)胞加載移植動脈部位的動脈脈搏波24-72小時，使血管內(nèi)皮細(xì)胞有充分的時間適應(yīng)生理水平的脈動剪切力。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，體外構(gòu)建具有抗流動剪切力和抗血小板凝集功能的血管內(nèi)皮層的方法，其特征在于:
[0008](I)在人造血管內(nèi)腔表面接種血管內(nèi)皮細(xì)胞；
[0009](2)將接種了血管內(nèi)皮細(xì)胞的人造血管培養(yǎng)24-48小時，從而使血管內(nèi)皮細(xì)胞長滿人造血管內(nèi)腔表面；
[0010](3)將長滿血管內(nèi)皮細(xì)胞的人造血管兩端連接到充滿了培養(yǎng)液的剪切力誘導(dǎo)系統(tǒng)的管路中，從而使人造血管和剪切力誘導(dǎo)系統(tǒng)的管路構(gòu)成一個封閉的回路；
[0011](4)啟動剪切力誘導(dǎo)系統(tǒng)的液體驅(qū)動泵，設(shè)定初始流速，從而使流經(jīng)人造血管內(nèi)腔的培養(yǎng)液對血管內(nèi)皮細(xì)胞的初始剪切力為0-2dyne/Cm2;
[0012](5)在剪切力施加一段時間后，調(diào)節(jié)液體驅(qū)動泵使培養(yǎng)液的流速比前一時間段流速提高一定比例，從而使人造血管內(nèi)腔的內(nèi)皮細(xì)胞受到的剪切力比前一時間段提高一定比例；
[0013]所述的剪切力施加一段時間，是施加剪切力1-4小時；
[0014]所述的調(diào)節(jié)液體驅(qū)動泵使培養(yǎng)液的流速比前一時間段流速提高一定比例，是培養(yǎng)液的流速比前一時間段流速提高5-20%之間的一個固定值；
[0015]所述的使人造血管內(nèi)腔的內(nèi)皮細(xì)胞受到的剪切力比前一時間段提高一定比例，是流動剪切力比前一時間段流速提高5-20%之間的一個固定值；
[0016](6)此后每隔一段時間，調(diào)節(jié)液體驅(qū)動泵使培養(yǎng)液的流速比前一時間段流速提高一定比例，從而使人造血管內(nèi)腔的內(nèi)皮細(xì)胞受到的剪切力比前一時間段提高一定比例；直到人造血管內(nèi)腔的內(nèi)皮細(xì)胞受到的剪切力達(dá)到移植部位動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞所承受的平均剪切力或剪切力峰值水平為止；
[0017]所述的此后每隔一段時間，是每隔1-4小時；
[0018]所述的調(diào)節(jié)液體驅(qū)動泵使培養(yǎng)液的流速比前一時間段流速提高一定比例，是培養(yǎng)液的流速比前一時間段流速提高5-20%之間的一個固定值；
[0019]所述的使人造血管內(nèi)腔的內(nèi)皮細(xì)胞受到的剪切力比前一時間段提高一定比例，是流動剪切力比前一時間段流速提高5-20%之間的一個固定值；
[0020](7)保持人造血管內(nèi)腔的血管內(nèi)皮細(xì)胞受到的平均剪切力在移植部位動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞所承受的平均剪切力或剪切力峰值水平，繼續(xù)培養(yǎng)24-72小時；
[0021](8)結(jié)束剪切力誘導(dǎo)，取下人造血管，用于后續(xù)生理指標(biāo)檢測及血管移植。
[0022]根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，體外構(gòu)建具有抗流動剪切力和抗血小板凝集功能的血管內(nèi)皮層的方法，其特征在于:
[0023](I)在人造血管內(nèi)腔表面接種血管內(nèi)皮細(xì)胞；
[0024](2)將接種了血管內(nèi)皮細(xì)胞的人造血管培養(yǎng)24-48小時，從而使內(nèi)皮細(xì)胞長滿人造血管內(nèi)腔表面；
[0025](3)將長滿內(nèi)皮細(xì)胞的人造血管兩端連接到充滿了培養(yǎng)液的剪切力誘導(dǎo)系統(tǒng)的管路中，從而使人造血管和剪切力誘導(dǎo)系統(tǒng)的管路構(gòu)成一個封閉的回路；
[0026](4)啟動剪切力誘導(dǎo)系統(tǒng)的液體驅(qū)動泵，設(shè)定初始流速，從而使流經(jīng)人造血管內(nèi)腔的培養(yǎng)液對血管內(nèi)皮細(xì)胞的初始剪切力為0-2dyne/Cm2;
[0027](5)在剪切力施加I小時后，調(diào)節(jié)液體驅(qū)動泵使培養(yǎng)液的流速比前一小時流