3、24、25、26、27、28、29、或 30 個氨基酸的最小長度。在進一步優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的肽接頭具有至少100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、或15個或者更少氨基酸的最大長度。優(yōu)選的是肽接頭提供了連接在一起的兩個氨基酸蛋白質(zhì)、片段、區(qū)段、表位和/或結(jié)構(gòu)域之間的柔性。如果氨基酸是小氨基酸，這種柔性通常會增加。因此，優(yōu)選地，本發(fā)明的肽接頭具有增加含量的小氨基酸，特別是甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、亮氨酸和異亮氨酸。優(yōu)選地，肽接頭超過20 %、30 %、40 %、50 %、60 %或更多的氨基酸是小氨基酸。在優(yōu)選的實施方案中，接頭的氨基酸選自甘氨酸和絲氨酸。在特別優(yōu)選的實施方案中，上面指出的優(yōu)選的根據(jù)本發(fā)明的最小和最大長度的肽接頭可以組合。技術(shù)人員會立即明白哪些組合在數(shù)學上是有意義的。在某些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的肽接頭是無免疫原性的；當設(shè)計來施用給人時，肽接頭通常選擇為對人類無免疫原性的。
[0080]本文所使用的術(shù)語“切割位點”是指氨基酸序列，其中該序列指導分裂，例如因為它被切割酶識別、和/或可以被分裂。一般而言，多肽鏈是通過連接氨基酸的一個或更多個肽鍵的水解而被切割的。肽鍵的切割可以源自化學或酶切割。酶切割是指通過蛋白水解酶內(nèi)肽酶或外肽酶或者蛋白酶(例如絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶、蘇氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶)而實現(xiàn)的這類切割。一般而言，酶切割的發(fā)生是由于自切割或者由獨立的蛋白水解酶實現(xiàn)。蛋白質(zhì)或多肽的酶切割可以在共翻譯中或翻譯后發(fā)生。因此，本文使用的術(shù)語“內(nèi)肽酶切割位點”是指氨基酸或核苷酸序列中的切割位點，其中該序列被內(nèi)肽酶(例如胰蛋白酶、胃蛋白酶、彈性蛋白酶、凝血酶、膠原酶、弗林蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、內(nèi)肽酶V8、組織蛋白酶)切割或者是可切割的?？蛇x地或額外地，本發(fā)明的多肽可以通過自體蛋白酶切割，即切割同一蛋白質(zhì)分子中的肽鍵的蛋白酶，該蛋白質(zhì)分子也包含該蛋白酶。這樣的自體蛋白酶的例子是來自黃病毒的NS2蛋白酶或者雙核糖核酸病毒的VP4蛋白酶。
[0081]可選地，術(shù)語“切割位點”是指阻止氨基酸之間的肽鍵形成的氨基酸序列。例如，鍵形成的阻止可以由于多肽或多聚蛋白質(zhì)的共翻譯自加工，其產(chǎn)生了來源于單個開放讀碼框的單個翻譯事件的兩個不連續(xù)翻譯產(chǎn)物。一般而言，這樣的自加工是通過由偽終止密碼子序列引起的“核糖體跳躍”所實現(xiàn)的，該偽終止密碼子序列誘導翻譯復合物從一個密碼子移動到下一個密碼子而不形成肽鍵。誘導核糖體跳躍的序列的例子包括但不限于病毒2A肽或2A樣肽(兩者本文中都被統(tǒng)稱為“2A肽”或者可互換的“2A位點”或“2A切割位點”)，這是幾個病毒家族所使用的，包括小RNA病毒、昆蟲病毒、Aphtoviridae、輪狀病毒和錐蟲。最有名的是細小RNA病毒科家族的鼻病毒和口蹄疫病毒的2A位點，其通常用于從單個ORF產(chǎn)生多個多肽。
[0082]因此，本文所使用的術(shù)語“自切割位點”是指氨基酸或核苷酸序列中的切割位點，其中該序列在這種切割不涉及任何額外分子的情況下被切割或可被切割，或者其中該序列中肽鍵或磷酸二酯鍵的形成首先被阻止(例如通過如上所述的共翻譯自加工)。
[0083]應當理解，切割位點通常包含幾個氨基酸或由幾個密碼子進行編碼(例如，在那些情況下，其中“切割位點”不翻譯成蛋白質(zhì)，但將導致翻譯的中斷)。因此，切割位點還可以用作肽接頭的目的，即在空間上分隔兩個肽。因此，在一些實施方案中，“切割位點”是肽接頭，并同時提供上述的切割功能。在該實施方案中，切割位點可以包含另外的N-和/或C-末端氨基酸。
[0084]在本發(fā)明的一個具體優(yōu)選的實施方案中，自切割位點選自由小RNA病毒、昆蟲病毒、Aphtoviridae、輪狀病毒和錐蟲的病毒2A肽或2A樣肽組成的組。在一個優(yōu)選的例子中，2A切割位點是口蹄疫病毒的2A肽。
[0085]在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，由第一和/或第二載體所包含的核酸構(gòu)建體編碼至少兩種免疫原性多肽，其中至少一種所述多肽誘導T細胞應答并且至少另一種多肽誘導B細胞應答。
[0086]在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，由第一和第二核酸構(gòu)建體所編碼的免疫原性多肽的氨基酸序列是基本上相同的。
[0087]在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，至少一種核酸構(gòu)建體編碼選自(i)呼吸道合胞病毒(RSV)的融合蛋白F、(ii) RSV的核蛋白N和(iii) RSV的基質(zhì)蛋白M2的至少一種多肽。
[0088]在本發(fā)明具體優(yōu)選的實施方案中，由第一和第二載體所包含的核酸構(gòu)建體編碼選自(i)呼吸道合胞病毒(RSV)的融合蛋白F、(ii) RSV的核蛋白N和(iii) RSV的基質(zhì)蛋白M2的相同的一種或多種多肽。術(shù)語“相同的一種或多種多肽(the same polypeptide orpolypeptides)”是指如上所定義的免疫學上相同的多肽，或者具有如上所定義的基本上相同的氨基酸序列的多肽。術(shù)語“相同的一種或多種多肽”是指具有相同的氨基酸序列的多肽。
[0089]在本發(fā)明的具體優(yōu)選的實施方案中，至少一種核酸構(gòu)建體編碼包含(i)呼吸道合胞病毒(RSV)的融合蛋白F、(ii) RSV的核蛋白N和(iii) RSV的基質(zhì)蛋白M2的多肽。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述核酸構(gòu)建體不編碼除前述三種多肽之外的任何多肽。例如，載體不包含前述核酸構(gòu)建體之外的另外的核酸構(gòu)建體，前述核酸構(gòu)建體編碼包含(i)呼吸道合胞病毒(RSV)的融合蛋白F、(ii) RSV的核蛋白N和(iii) RSV的基質(zhì)蛋白M2的多肽。
[0090]在本發(fā)明的一個極優(yōu)選的實施方案中，兩種核酸構(gòu)建體都編碼包含(i)呼吸道合胞病毒(RSV)的融合蛋白F、(ii)RSV的核蛋白N和(iii)RSV的基質(zhì)蛋白M2的多肽。對于該實施方案的例子，兩種核酸構(gòu)建體都不編碼除前述三種多肽之外的任何多肽。例如，兩種載體都不包含前述核酸構(gòu)建體之外的另外的核酸構(gòu)建體，前述核酸構(gòu)建體編碼包含(i)呼吸道合胞病毒(RSV)的融合蛋白F、(ii) RSV的核蛋白N和(iii) RSV的基質(zhì)蛋白M2的多肽。
[0091]疫苗
術(shù)語“疫苗”是指改善針對具體疾病的免疫能力的生物制劑。所述制劑可以包含殺死或減毒活病原體。它也可以包含來源于適合引發(fā)免疫應答的病原體的一種或更多種化合物。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，所述化合物是與所述病原體多肽基本上相同或者免疫學上相同的多肽。還優(yōu)選地，疫苗包含編碼免疫原性多肽的核酸構(gòu)建體，該多肽與所述病原體多肽基本上相同或者免疫學上相同。在后一種情況下，希望的是多肽在用疫苗治療的個體中表達。接種的原理基本是免疫“記憶”的產(chǎn)生。用疫苗攻擊個體的免疫系統(tǒng)將誘導免疫細胞的形成和/或增殖，該免疫細胞特異性識別包含在疫苗中的化合物。至少所述免疫細胞的一部分保持存活一段時間，該時間段可以延長至接種后10年、20年或30年。如果個體的免疫系統(tǒng)在前述時間段內(nèi)遇到能夠引發(fā)免疫應答的化合物所來源的病原體，則通過接種所產(chǎn)生的免疫細胞將重新激活，并增強對病原體的免疫應答，相比沒有用疫苗攻擊且第一次遇到病原體的免疫原性化合物的個體的免疫應答。
[0092]初免-加強接種方案
在許多情況下，疫苗的單次施用不足以產(chǎn)生在所述病原體的將來感染的情況下有效保護所需的長效免疫細胞的數(shù)量，以保護針對疾病包括腫瘤疾病或者用于治療性治療疾病如腫瘤疾病。因此，用特異性針對具體病原體或疾病的生物制劑進行重復攻擊是建立針對所述病原體或疾病的持久且保護性的免疫力或者治愈給定疾病所需的。包含針對相同病原體或疾病的疫苗重復施用的施用方案在本申請中稱為“初免-加強接種方案”。優(yōu)選地，初免-加強接種方案涉及針對具體病原體、病原體組或疾病的疫苗或疫苗組合物的至少兩次施用。疫苗的第一次施用稱為“初免”，并且相同疫苗或者針對與第一次疫苗相同的病原體的疫苗的任何后續(xù)施用可以稱為“加強”。因此，在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，初免-加強接種方案涉及用于初免免疫應答的一次疫苗施用以及用于加強免疫應答的至少一次后續(xù)施用。應該理解的是，用于加強免疫應答的2、3、4或甚至5次施用也是本發(fā)明所預期的。
[0093]初免和后續(xù)施用之間的時間段優(yōu)選為I周、2周、4周、6周或8周。更優(yōu)選地，它是4周。如果進行一次以上的加強，后續(xù)加強優(yōu)選地在前次加強I周、2周、4周、6周或8周后進行施用。例如，時間間隔為4周。
[0094]要用根據(jù)本發(fā)明的初免-加強方案治療的對象或病人優(yōu)選哺乳動物或鳥類，更優(yōu)選靈長類、小鼠、大鼠、綿羊、山羊、牛、豬、馬、鵝、雞、鴨或火雞，以及最優(yōu)選人。
[0095]優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明第一或第二方面的疫苗組合使用將建立針對病原體或疾病的保護性免疫力，或者將導致由病原體感染所引起的感染或疾病的抑制和/或根除。
[0096]疫苗組合物
在“初免組合物”和“加強組合物”中使用的術(shù)語“組合物”是指包含核酸構(gòu)建體以及選自藥學上可接受的載體、藥學賦形劑和佐劑的至少一種另外的化合物的載體組合。如果加強組合物包含免疫原性多肽而不是載體，那么加強組合物包含所述的至少一種免疫原性多肽以及選自藥學上可接受的載體、藥學賦形劑和佐劑的至少一種另外的化合物。
[0097]“藥學上可接受的”意指經(jīng)聯(lián)邦或州政府監(jiān)管機構(gòu)批準的或者列在美國藥典或其他一般公認的藥典中用于動物中，并且更具體是用于人的。
[0098]本文使用的術(shù)語“載體”是指藥理學上無活性的物質(zhì)，例如但不限于與治療性活性成分一起施用的稀釋劑、賦形劑或媒介物。這樣的藥學載體可以是液體或固體。液體載體包括但不限于無菌液體，諸如在水和油中的鹽水溶液，包括石油、動物、植物或合成來源的那些，諸如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。鹽水溶液以及含水葡萄糖和甘油溶液也可以用作液體載體，特別是用于可注射溶液。當藥物組合物是靜脈內(nèi)或通過噴霧器鼻內(nèi)施用時，鹽水溶液是優(yōu)選的載體。
[0099]合適的藥學賦形劑包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、大米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油醋、滑石、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。
[0100]合適的藥學載體的例子是描述于E.ff.Martin的〃Remington’s PharmaceuticalSciences"中。
[0101]術(shù)語“佐劑”是指在細胞或體液水平增加、刺激、激活、增強(potentiate)或調(diào)節(jié)對組合物活性成分的免疫應答的試劑，例如刺激免疫系統(tǒng)對真實抗原的應答，但它們本身沒有免疫效應。這些佐劑的實例包括但不限于無機佐劑(例如無機金屬鹽，諸如磷酸鋁或氫氧化鋁)，有機佐劑(例如皂苷或角鯊稀)，油基佐劑(例如弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑)，細胞因子(例如IL-1 β、IL-2、IL-7、IL-12、IL-18, GM-CFS和INF-γ )，顆粒佐劑(例如免疫刺激復合物(ISC0MS)、脂質(zhì)體或可生物降解的微球體)，病毒體，細菌佐劑(例如單磷酰脂質(zhì)A或者胞壁肽)，合成佐劑(例如非離子型嵌段共聚物、胞壁肽類似物或者合成脂質(zhì)Α)，或者合成的多核苷酸佐劑(例如聚精氨酸和聚賴氨酸)。
[0102]“鼻內(nèi)施用”是向完整呼吸道(包括肺)粘膜施用本發(fā)明的疫苗組合物。更優(yōu)選地，組合物施用到鼻粘膜。優(yōu)選地，鼻內(nèi)施用是通過滴注、噴霧或氣霧劑實現(xiàn)的。優(yōu)選地，所述施用不涉及通過機械方式諸如針進行的粘膜穿孔。
[0103]術(shù)語“肌內(nèi)施用”是指將疫苗組合物注射入個體的任何肌肉中。優(yōu)選的肌內(nèi)注射是施用到三角肌、股外側(cè)肌或者臀部腹腔間和背肩部。
[0104]驚奇地發(fā)現(xiàn)，多核苷酸載體和蛋白質(zhì)的施用組合提供了在接種的特性(例如強度)方面的優(yōu)點。因此，本發(fā)明進一步的方面涉及疫苗組合，其包含:
(a)包含、基本上由或者由包含核酸構(gòu)建體的載體組成的初免組合物，所述核酸構(gòu)建體編碼至少一種免疫原性多肽，以及
(b)包含、基本上由或者由至少一種免疫原性多肽組成的至少一種加強組合物，
其中包含在初免組合物中的由核酸構(gòu)建體編碼的免疫原性多肽的至少一個表位與包含在加強組合物中的免疫原性多肽的至少一個表位是免疫學上相同的，其用于初免-加強免疫接種方案，其中初免組合物是肌內(nèi)或鼻內(nèi)施用的，并且至少一種加強組合物隨后施用。
[0105]在本發(fā)明第二方面的上下文中，所有術(shù)語具有本發(fā)明第一方面有關(guān)的上述定義的含義，并在指出的地方具有優(yōu)選含義。特別地，術(shù)語載體、核酸構(gòu)建體、免疫原性多肽、肌內(nèi)或鼻內(nèi)施用、初免加強接種方案具有上述含義。應該理解的是，與免疫原性多肽有關(guān)的教導可適用于由載體核酸編碼的免疫原性多肽以及如此施用的多肽，而與核酸構(gòu)建體有關(guān)的教導只與包含在載體中的核酸有關(guān)。
[0106]優(yōu)選的是至少一種加強組合物是肌內(nèi)或鼻內(nèi)施用的。優(yōu)選地，每種加強組合物都是肌內(nèi)或鼻內(nèi)施用的。
[0107]優(yōu)選的施用方案如下: (i)初免組合物是鼻內(nèi)施用的，并且至少一種加強組合物隨后肌內(nèi)施用；
(ii)初免組合物是鼻內(nèi)施用的，并且至少一種加強組合物隨后鼻內(nèi)施用。
[0108](ii)初免組合物是肌內(nèi)施用的，并且至少一種加強組合物隨后肌內(nèi)施用；或者 (iv)初免組合物是肌內(nèi)施用的，并且至少一種加強組合物隨后鼻內(nèi)施用，最優(yōu)選使用施用方案(i)。
[0109]在該方面優(yōu)選的實施方案中，載體選自腺病毒載體、腺相關(guān)病毒(AAV)載體(例如AAV 5型和2型)、甲病毒載體(例如委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(VEE)、辛德畢斯病毒(SIN)、西門利克森林病毒(SFV)和VEE-SIN嵌合體)、皰瘆病毒載體(例如源自巨細胞病毒的載體，如恒河猴巨細胞病毒(RhCMV) (14))、沙粒病毒載體(例如淋巴細胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(LCMV)載體(15))、麻瘆病毒載體、痘病毒載體(例如牛痘病毒、修飾的安卡拉牛痘病毒(MVA)、NYVAC (源自牛痘哥本哈根株)和禽痘病毒載體:金絲雀痘病毒(ALVAC)和雞痘病毒(FPV)載體)，水泡性口炎病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、病毒樣顆粒和細菌孢子。
[0110]非常優(yōu)選的載體是腺病毒載體，具體而言是源自人或非人的類人猿的腺病毒載體或者痘病