針對(duì)丙型肝炎病毒的嵌合疫苗抗原的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)和制藥工業(yè)領(lǐng)域，特別地涉及針對(duì)丙型肝炎病毒（HCV)的嵌合抗 原和包含所述嵌合抗原的疫苗組合物的開(kāi)發(fā)。在本發(fā)明中，使用最少數(shù)目的組分，因?yàn)樗?嵌合抗原能夠誘導(dǎo)增強(qiáng)的且多樣的針對(duì)HCV的抗原的免疫應(yīng)答，這通過(guò)精確選擇對(duì)于所述 抗原來(lái)說(shuō)特異的區(qū)域和包括對(duì)于CD4+ T淋巴細(xì)胞來(lái)說(shuō)特異的人工表位來(lái)實(shí)現(xiàn)。 現(xiàn)有技術(shù)
[0002] HCV 感染全世界人口 的大約 3% (Williams R·，H印atology, 2006, 44:521-526)。 大多數(shù)被感染的個(gè)體行進(jìn)至慢性（Amoroso P等人，J Hepatol, 1998, 28:939-944)。 丙型肝炎是慢性肝損傷、肝硬化、肝功能衰竭和肝癌的主要原因之一（Hoofnagle JH.，H印atology，2002, 36(5Suppl I) :S21-S29)。目前，它在第一世界國(guó)家中是肝移植的主 要原因。另外，HCV感染與肝外表現(xiàn)（尤其是例如II型冷球蛋白血癥、膜性增生性腎小球腎 炎、遲發(fā)性皮膚卟啉癥）有關(guān)。不存在針對(duì)該病毒的預(yù)防性疫苗，并且在使用中的基于PEG 化的干擾素（IFN) +利巴韋林的組合的抗病毒治療在少于50%的病例中是有效的。此外，這 些治療引起多重不良事件（Ghany MG 等人，!fepatology, 2009, 49 (4) : 1335-74)。
[0003] HCV是屬于黃病毒科丙型肝炎病毒屬的一種病毒。它是有包膜的病毒，其病 毒顆粒具有50至70nm的大小，并且與極低密度脂蛋白（VLDL)相聯(lián)合（Popescu Cl和 Dubuisson, J. Biol Cell, 2009, 102 (1):63-74)。病毒基因組為大約 9. 6kb 的正極性的單 鏈核糖核酸（RNA)。該基因組編碼病毒多蛋白，其以共翻譯和翻譯后方式被加工成至少 10種病毒蛋白：核心、EU E2、p7(結(jié)構(gòu)蛋白），和非結(jié)構(gòu)蛋白NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、 NS5B (Bartenschlager R和 Lohmann V·，2000,J Gen Virol, 81:1631-48)〇
[0004] 對(duì)于獲得針對(duì)HCV的有效疫苗，存在若干重大的障礙。該病原體是RNA病毒，其可 以快速突變以適應(yīng)宿主環(huán)境。這對(duì)世界上鑒定出的多種病毒分離物的序列的高度多樣性 做出了貢獻(xiàn)。已描述了六種主要的基因型，其在核苷酸序列水平上可以達(dá)到相差直至30% (Simmonds P·，J Hepatol, 1999, 31Suppl 1:54-60)。最大的異質(zhì)性存在于 HCV 的 E2 蛋白 的高變區(qū)中，其中恰好存在對(duì)于中和抗體的可能的靶表位。事實(shí)上，HCV作為異質(zhì)的病毒分 子群體在生物體中循環(huán)，這是稱為"準(zhǔn)種"的現(xiàn)象（Simmonds P.，J Gen Virol, 2004, 85 (Pt 11) :3173-88)。已證明突變是一種對(duì)由宿主發(fā)展出的特異性免疫應(yīng)答（體液的以及細(xì)胞 的）進(jìn)行逃逸的方式。
[0005] 應(yīng)當(dāng)強(qiáng)調(diào)，HCV在具有免疫能力的個(gè)體中造成持續(xù)感染，盡管存在活躍的免疫應(yīng)答 (Lechmann等人，Semin Liver Dis, 2000, 20, 211-226)。目前，已闡明了數(shù)種對(duì)于免疫系統(tǒng) 的病毒效應(yīng)，其通過(guò)促進(jìn)不相關(guān)的免疫應(yīng)答的發(fā)展和阻止對(duì)于病毒去除來(lái)說(shuō)真正有效的應(yīng) 答的發(fā)展而有助于病毒的持續(xù)存在。無(wú)論在先天免疫中還是在獲得性免疫中，均看到這些 效應(yīng)（Grakoui A 等人，Science, 2003, 302 (5645) : 659-62)。存在這樣的證據(jù)：針對(duì) HCV 的 無(wú)效免疫應(yīng)答不僅不能達(dá)到去除該病原體，而且還有助于肝損傷。
[0006] 迄今為止，還沒(méi)有完全確定與針對(duì)HCV感染的保護(hù)或病毒澄清相關(guān)聯(lián)的免疫學(xué)參 數(shù)。然而，估計(jì)針對(duì)各種不同病毒抗原的強(qiáng)力且持續(xù)的細(xì)胞免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)是特別重要的 (Lechmann 等人，Semin Liver Dis, 2000, 20, 211-226)。在被 HCV 慢性感染的個(gè)體中，對(duì)于 特異性T淋巴細(xì)胞的應(yīng)答的影響是特別引人注意的。幾種機(jī)制看起來(lái)對(duì)于該效應(yīng)做出了貢 獻(xiàn)，其中之一是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的作用。
[0007] 為了開(kāi)發(fā)針對(duì)HCV的疫苗，已研宄了幾乎所有的免疫接種策略。在這些策略中 強(qiáng)調(diào)了重組蛋白、合成肽、病毒樣顆粒、裸脫氧核糖核酸（DNA)和重組病毒的使用。作 為針對(duì)HCV的疫苗候選物的靶標(biāo)，已評(píng)價(jià)了所有的病毒抗原。大多數(shù)的疫苗候選物依 然集中于在動(dòng)物模型中的免疫原性研宄的階段，雖然目前幾個(gè)候選物處于臨床階段，其 中經(jīng)證明是安全的和具有免疫原性的，但還沒(méi)有臨床影響的證明（Alvarez-Lajonchere L，Duefias-Carrera S·，Int Rev Immunol, 2012, 31 (3) :223-42) 〇
[0008] 基于蛋白質(zhì)亞基的疫苗的開(kāi)發(fā)是對(duì)于HCV所評(píng)價(jià)的首要策略之一。所提出的基 于HCV的結(jié)構(gòu)區(qū)域的抗原的策略中的一些已在動(dòng)物模型中取得了有限的針對(duì)該病毒的 保護(hù)。用由El和Ε2蛋白形成的寡聚體進(jìn)行免疫接種的黑猩猩的情況就是這樣的。對(duì) 七只黑猩猩進(jìn)行了疫苗接種，其中五只得到保護(hù)，和兩只得病，但被治愈而未進(jìn)展為慢性 期（Choo 等人，Proc Natl Acad Sci USA, 1994,91，1294-1298)。已將所述保護(hù)作用與 能夠抑制E2與人細(xì)胞結(jié)合的抗體（Ab)的存在相關(guān)聯(lián)（Rosa等人，Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93, 1759-1763)。
[0009] 作為同源二聚體，純化出了來(lái)自基因型Ib分離物的重組El蛋白（Maertens等 人，Acta Gastroenterol Belg, 2000, 63, 203)。兩只被HCV慢性感染的黑猩猩接受9個(gè)劑 量的50 μ g重組El蛋白。該疫苗接種改善了肝組織學(xué)，招致了病毒抗原從肝臟中消失，和降 低了丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT)水平。盡管在血清中的病毒RNA水平在治療期間未改變，但 在結(jié)束治療后肝臟炎癥和病毒抗原重新出現(xiàn)。觀察到在高水平的針對(duì)El的抗體與肝損傷 的減少之間的聯(lián)系（Maertens 等人，Acta Gastroenterol Belg, 2000, 63, 203)。甚至在人 中評(píng)價(jià)了在氧化鋁中配制的HCV的El的蛋白變體。該疫苗候選物經(jīng)證明是安全的和具有 免疫原性的，從而能夠誘導(dǎo)抗體應(yīng)答以及特異性的淋巴組織增生性應(yīng)答（Nevens F.等人，H 印atology，2003, 38 (5) : 1289-96)。然而，該疫苗候選物的施用沒(méi)有達(dá)到在臨床上影響HCV感 染，因?yàn)槲磳?shí)現(xiàn)在患者中的病毒澄清，也未觀察到肝臟疾病的顯著改善。用完整的蛋白質(zhì)亞 基進(jìn)行免疫接種的分析研宄具有在某些情況下不誘導(dǎo)強(qiáng)烈的細(xì)胞應(yīng)答的缺點(diǎn)。此外，該分 析研宄還冒這樣的風(fēng)險(xiǎn)：包括了在以各種不同水平影響由該病原體誘導(dǎo)的抗-HCV免疫應(yīng) 答的各種不同機(jī)制中所牽涉的區(qū)域（Grakoui A等人，Science, 2003, 302(5645) :659-62)。
[0010] 基于包含對(duì)于T淋巴細(xì)胞來(lái)說(shuō)特異的HCV表位的合成肽的混合物的兩個(gè)疫苗候選 物也已達(dá)到了在人中的臨床評(píng)價(jià)階段（Yutani等人，Cancer Sci, 2009, 100(10) :1935-42 ; Klade 等人，Gastroenterology, 2008, 134 (5) : 1385-95)。在被HCV 慢性感染的個(gè)體中，這兩 個(gè)疫苗候選物都顯示出誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答的能力，并且在迄今進(jìn)行的I和II期臨床研宄 中經(jīng)證明具有很低的反應(yīng)原性（Alvarez-Lajonchere L, Duefias-CarreraS.，Int Rev Immunol, 2012, 31 (3) : 223-42)。然而，它們還沒(méi)有達(dá)到顯著地影響患者的病毒載量，或者僅 暫時(shí)地影響。鑒于還沒(méi)有證明它們能夠改善患者的肝組織學(xué)參數(shù)，這些疫苗候選物的臨床 影響還有待證實(shí)。在HCV的病毒多蛋白中的數(shù)種對(duì)于CD4+和CD8+T細(xì)胞的表位（其在病毒 澄清中可能是重要的）的鑒定支持了使用合成肽作為針對(duì)該病原體的疫苗候選物的策略。 包含核心、NS4和NS5的表位的各種不同的肽（單獨(dú)的或脂質(zhì)化的）已在小鼠中誘導(dǎo)了強(qiáng) 烈的細(xì)胞毒性T細(xì)胞類型的應(yīng)答（Shirai等人，J Infect Dis, 1996, 173, 24-31 ;Hiranuma 等人，J Gen Virol, 1999, 80, 187-193 ;Oseroff 等人，Vaccine, 1998, 16, 823-833)。關(guān)于 肽疫苗分析研宄的主要障礙在于，沒(méi)有輔助功能的那些肽可能是差的免疫原；此外，疫苗的 效力經(jīng)?；卺槍?duì)各種不同抗原的廣譜的多價(jià)應(yīng)答的誘導(dǎo)。由于包括在疫苗制備物中的肽 的數(shù)目增加，因而從所有觀點(diǎn)來(lái)看，制劑的復(fù)雜性更高了。這些限制代表了該策略的弱點(diǎn)。
[0011] 另一方面，已經(jīng)在針對(duì)HCV的疫苗的開(kāi)發(fā)中評(píng)價(jià)了各種不同的重組病毒載 體。缺陷型重組腺病毒是具有吸引力的候選物，這歸因于其趨肝性、其誘導(dǎo)體液免疫以 及細(xì)胞免疫的潛力以及通過(guò)腸胃外和口服途徑進(jìn)行施用的可能性。包含編碼HCV的結(jié) 構(gòu)蛋白的基因的重組腺病毒誘導(dǎo)針對(duì)這些蛋白質(zhì)中的每一種的抗體應(yīng)答（Makimura等 人，Vaccine, 1996, 14, 28-36)。此外，在用對(duì)于核心和El而言重組的腺病毒對(duì)小鼠進(jìn)行 免疫接種后，檢測(cè)到針對(duì)這些抗原的特異性的細(xì)胞毒性T細(xì)胞類型的應(yīng)答（Bruna-Romero 等人，!fepatology，1997, 25, 470-477)。雖然這些結(jié)果是令人鼓舞的，但是一些關(guān)于在基 因療法中使用重組腺病毒的問(wèn)題使得對(duì)于其在人中的安全使用產(chǎn)生了疑問(wèn)。目前，一種 基于重組腺病毒的疫苗候選物處于在人中的評(píng)價(jià)之中，該疫苗候選物逐漸表明是具有免 疫原性的，但沒(méi)有經(jīng)證實(shí)的臨床影響（Barnes等人，Sci Transl Med, 2012, 4(115) : 115)。 包含HCV的各種不同基因的牛痘、金絲雀痘和禽痘類型的其他重組病毒的使用使得 能夠在小鼠中誘導(dǎo)出強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性和輔助性T細(xì)胞類型的應(yīng)答（Shirai等人，J Virol, 1994, 68, 3334-3342 ;Large 等人，J Immunol, 1999, 162, 931-938)。特別地，已在人 中的臨床研宄之中評(píng)價(jià)了對(duì)于HCV的非結(jié)構(gòu)抗原NS3至NS5而言重組的經(jīng)修飾的安卡拉痘 苗病毒變體（FourniIlier等人，Vaccine, 2007, 25(42) :7339-53)。在被HCV慢性感染的個(gè) 體中的I期臨床研宄之中，該候選物經(jīng)證明是具有免疫原性的，并且是被良好地耐受的。與 在基于肽的變化形式中同樣地，僅在一部分已接種疫苗者中且暫時(shí)地觀察到用該疫苗候選 物進(jìn)行免疫接種對(duì)于病毒載量的影響。因此，同樣地，臨床影響有待證實(shí)。一般而言，基于 重組病毒的疫苗變化形式受到與其應(yīng)用相關(guān)的安全性問(wèn)題和規(guī)章制度的影響。
[0012] 為了可能開(kāi)發(fā)出針對(duì)HCV的疫苗，已詳盡地研宄了用DNA進(jìn)行免疫接種。在 動(dòng)物模型中的研宄已證明了該免疫接種策略誘導(dǎo)針對(duì)HCV的幾乎所有抗原的特異性免 疫應(yīng)答（體液的以及細(xì)胞的）的能力（Alvarez-Lajonchere L, Dliefias-Carrera S, Hu