V多蛋 白的氨基酸192-340)、E2蛋白（HCV多蛋白的氨基酸384-680)和NS3蛋白（在HCV多蛋白 中的氨基酸1192至1457)的重組變體作為在ELISA中的包被抗原，檢測(cè)了所評(píng)價(jià)的應(yīng)答。
[0055] 圖20.在用各種不同的包括人工表位和NS3蛋白的表位的嵌合抗原進(jìn)行的免疫接 種方案中針對(duì)HCV蛋白質(zhì)的增殖應(yīng)答。結(jié)果作為在借助于CFSE染色的細(xì)胞計(jì)量術(shù)測(cè)定法 中測(cè)定的刺激指數(shù)顯示在Y軸上。在X軸上顯示了向BALB/c小鼠施用的各種不同免疫原。 誤差條顯示了同一組動(dòng)物的平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。通過(guò)使用核心蛋白（衣殼蛋白的氨基酸 1-120)、El蛋白（HCV多蛋白的氨基酸192-340)、E2蛋白（HCV多蛋白的氨基酸384-680) 和NS3蛋白（在HCV多蛋白中的氨基酸1192至1457)的重組變體作為用于刺激細(xì)胞的抗 原，檢測(cè)了所評(píng)價(jià)的應(yīng)答。
[0056] 圖21.在用各種不同的包括人工表位和NS3蛋白的表位的嵌合抗原進(jìn)行的免疫接 種方案中針對(duì)HCV蛋白質(zhì)的IFNy分泌應(yīng)答。結(jié)果作為在IFNy分泌的ELISP0T測(cè)定法中 測(cè)定的"凈斑點(diǎn)數(shù)/百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞"顯示在Y軸上。在X軸上顯示了向BALB/c小鼠施用的各 種不同免疫原。誤差條顯示了同一組動(dòng)物的平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。通過(guò)使用核心蛋白（衣殼 蛋白的氨基酸1-120)、E1蛋白（HCV多蛋白的氨基酸192-340)、E2蛋白（HCV多蛋白的氨基 酸384-680)和NS3蛋白（在HCV多蛋白中的氨基酸1192至1457)的重組變體作為用于刺 激細(xì)胞的抗原，檢測(cè)了所評(píng)價(jià)的應(yīng)答。
[0057] 圖22.在用各種不同的包括人工表位和NS3蛋白的表位的嵌合抗原進(jìn)行的免疫接 種方案中針對(duì)病毒攻擊的應(yīng)答。結(jié)果作為在病毒攻擊后在雌性小鼠卵巢中檢測(cè)到的病毒滴 度的對(duì)數(shù)顯示在Y軸上。對(duì)于病毒攻擊，使用病毒W(wǎng)RE和WR。在X軸上顯示了向BALB/c 小鼠施用的各種不同免疫原。誤差條顯示了同一組動(dòng)物的平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。
[0058] 圖23.在用嵌合抗原Eql和Eqlb進(jìn)行的免疫接種方案中針對(duì)HCV蛋白質(zhì)的抗體應(yīng) 答。結(jié)果作為通過(guò)ELISA測(cè)定的抗體滴度的倒數(shù)顯示在Y軸上。在X軸上顯示了向BALB/ c小鼠施用的各種不同免疫原。誤差條顯示了同一組動(dòng)物的平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。通過(guò)使用 核心蛋白（衣殼蛋白的氨基酸1-120)、El蛋白（HCV多蛋白的氨基酸192-340)和E2蛋白 (HCV多蛋白的氨基酸384-680)的重組變體作為在ELISA中的包被抗原，檢測(cè)了所評(píng)價(jià)的應(yīng) 答。
[0059] 圖24.在用嵌合抗原Eql和Eqlb進(jìn)行的免疫接種方案中針對(duì)HCV蛋白質(zhì)的增殖 應(yīng)答。結(jié)果作為在借助于CFSE染色的細(xì)胞計(jì)量術(shù)測(cè)定法中測(cè)定的刺激指數(shù)顯示在Y軸上。 大于2的刺激指數(shù)被認(rèn)為是陽(yáng)性應(yīng)答。在X軸上顯示了向BALB/c小鼠施用的各種不同免 疫原。誤差條顯示了同一組動(dòng)物的平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。通過(guò)使用核心蛋白（衣殼蛋白的 氨基酸1-120)、El蛋白（HCV多蛋白的氨基酸192-340)和E2蛋白（HCV多蛋白的氨基酸 384-680)的重組變體作為用于刺激細(xì)胞的抗原，檢測(cè)了所評(píng)價(jià)的應(yīng)答。
[0060] 圖25.在用嵌合抗原Eql和Eqlb進(jìn)行的免疫接種方案中針對(duì)病毒攻擊的應(yīng)答。結(jié) 果作為在病毒攻擊后在雌性小鼠卵巢中檢測(cè)到的病毒滴度的對(duì)數(shù)顯示在Y軸上。對(duì)于病毒 攻擊，使用病毒vvRE和WR。在X軸上顯示了向BALB/c小鼠施用的各種不同免疫原。誤差 條顯示了同一組動(dòng)物的平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。
[0061] 實(shí)施方式的詳細(xì)描述/實(shí)施例
[0062] 實(shí)施例1.各種不同的包含HCV表位的嵌合抗原的獲得
[0063] 如在圖 1 中所顯示的，獲得了質(zhì)粒 pMCo64K(SEQ ID No. 1)、pME64K(SEQ ID No.2)、pIME164K(SEQ ID No.3)、pINSE64K(SEQ ID No.4)、pIENSb(SEQ ID Νο·5)、 pIENS3(SEQ ID No.6)、pMPlE64K(SEQ ID No.7)、pME64Kb(SEQ ID Νο·8)。這些質(zhì) 粒分別使得能夠在大腸桿菌（Escherichia coli)中表達(dá)在圖2中所呈現(xiàn)的嵌合抗原 Coql(SEQ ID No. 9)、Eql (SEQ ID No. 10)、Elql(SEQ ID No. 11)、NSEq2(SEQ ID No. 12)、 EqNSb(SEQ ID No. 13)、EqNS3(SEQ ID No. 14)、EqPl (SEQ ID No. 15)和 Eqlb(SEQ ID No. 16)。除了抗原Eqlb(其序列來(lái)自基因型Ia的HCV H77變體）外，在所有情況下，氨 基酸序列均來(lái)自基因型Ib的HCV分離物（Gonzdilez-Horta EE, Eur Rev Med Pharmacol Sci，2011，15(11) :1320-7)。
[0064] 如在圖2中所顯示的，嵌合抗原Coql (SEQ ID No. 9)包含HCV多蛋白的核心區(qū)域 (氨基酸1-50)、El區(qū)域（氨基酸190-222)和E2區(qū)域（氨基酸408-540)，它們特別地以 該順序進(jìn)行布置。嵌合抗原Eql (SEQ ID No. 10)同樣地包含HCV多蛋白的E2區(qū)域（氨基 酸408-540)、El區(qū)域（氨基酸190-222)和核心區(qū)域（氨基酸1-50)，但以該特定的順序。 嵌合抗原ElqUSEQ ID No. 11)包含相同的區(qū)域，但以HCV多蛋白的El (氨基酸190-222)、 E2(氨基酸408-540)和核心（氨基酸1-50)這樣的順序。嵌合抗原NSEq2(SEQ ID No. 12) 包括在El區(qū)域（氨基酸190-222)和核心區(qū)域（氨基酸1-50)之間插入到Eql中的表位P2B 和PlM (以該順序）。另一方面，嵌合抗原EqNSb (SEQ ID No. 13)包括在El區(qū)域（氨基酸 190-222)和核心區(qū)域（氨基酸1-50)之間插入到Eql中的表位P2B。嵌合抗原EqNS3(SEQ ID No. 14)包括插入在嵌合抗原Eql的El區(qū)域（氨基酸190-222)和核心區(qū)域（氨基酸 1-50)之間的HCV多蛋白的氨基酸1242-1415的區(qū)域。嵌合抗原EqPl(SEQ ID No. 15)包括 在El區(qū)域（氨基酸190-222)和核心區(qū)域（氨基酸1-50)之間插入到Eql中的表位P1M。 嵌合抗原Eqlb(SEQ ID No. 16)包含HCV多蛋白的E2區(qū)域（氨基酸408-540)、E1區(qū)域（氨 基酸190-222)和核心區(qū)域（氨基酸1-50)，以該特定的順序，但在該情況下氨基酸序列相應(yīng) 于基因型Ia的HCV的H77變體的序列（NCBI參考序列：NC_004102. 1)。
[0065] 通過(guò)生物信息學(xué)設(shè)計(jì)被包括在某些嵌合抗原中的人工表位PlM和P2B，以用于 被人輔助性T淋巴細(xì)胞所識(shí)別。通過(guò)使用程序Rankp印、SYFPETHI和ProPred研宄了與 HLA-DR13和HLA-DRll結(jié)合的基序，以建議在所述人工表位中每個(gè)位置的氨基酸變化形式， 主要根據(jù)出現(xiàn)頻率。作為對(duì)于輔助性T淋巴細(xì)胞的人工表位，描述了具有14個(gè)氨基酸的表 位P1M，其序列為L(zhǎng)PEYVMVKLPSRA(SEQ ID No. 17);和具有15個(gè)氨基酸的表位P2B，其序列 為 GYKVIVLNPRVASTL(SEQ ID No.18)。
[0066] 關(guān)于重組蛋白質(zhì)抗原的表達(dá)，用各自的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株GC-366的感受態(tài) 細(xì)胞。重組蛋白的表達(dá)在37攝氏度下進(jìn)行12小時(shí)，其中使用用于細(xì)胞培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基。 所有的蛋白質(zhì)抗原在其N-末端包含來(lái)自腦膜炎奈瑟氏球菌（Neisseria meningitidis) P64K蛋白的使表達(dá)穩(wěn)定化的片段，其以前因該功能而為人所知（Yero D等人，Biotechnol Appl Biochem, 2006, 44 (Pt 1):27-34)。另一方面，所述蛋白變體在其C-末端包含6個(gè)組 氨酸的尾標(biāo)，目的是有利于其純化。事實(shí)上，通過(guò)用碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液（pH 9.6)、8M 尿素溶解來(lái)自細(xì)胞破裂的不溶性級(jí)分和隨后進(jìn)行金屬螯合親和層析，來(lái)純化所述蛋白質(zhì)。 [0067] 實(shí)施例2.各種不同的包含HCV表位的嵌合抗原在小鼠中的免疫原性的研宄
[0068] 對(duì)體重為16_18g的8周齡的雌性BALB/c小鼠進(jìn)行免疫接種，每組17只動(dòng)物。免 疫接種組為下列：組1，佐以氧化鋁的嵌合抗原Coql ;組2,佐以氧化鋁的抗原Elql ;組3,佐 以氧化鋁的抗原Eql;組4,氧化鋁（對(duì)照組）。在所有情況下，施用20 μ g的重組抗原。所 述免疫接種在第〇、2和4周通過(guò)肌內(nèi)注射來(lái)進(jìn)行。
[0069] 在第0和6周進(jìn)行血液抽取，以研宄針對(duì)HCV的抗原的抗體應(yīng)答。此外， 在第6周，每組處死5只小鼠，以研宄特異性細(xì)胞應(yīng)答。另外，在第6周，每組用表 達(dá)HCV的結(jié)構(gòu)抗原的重組痘苗病毒vvRE (Alvarez-Lajonchere等人，Biotecnologia Aplicada, 2007, 24 (3-4) : 246-253)攻擊5只動(dòng)物，和用對(duì)照痘苗病毒W(wǎng)R攻擊另外5 只動(dòng)物。在五天之后，處死小鼠，并且如先前所描述的那樣測(cè)定在卵巢中的病毒滴度 (Alvarez-Lajonchere 等人，Biotechnol Appl Biochem, 2008, 51 (Pt 2) :97-105) 〇
[0070] 在圖3至5中顯示了針對(duì)HCV的抗原的特異性免疫應(yīng)答。通過(guò)使用核心蛋白 (衣殼蛋白的氨基酸 1_120，Alvarez-Obregon JC 等人，Vaccine, 2001，19:3940-3946)、 El 蛋白（HCV 多蛋白的氨基酸 192-340，Lorenzo LJ 等人，Biotechnol Appl Biochem, 2000, 32(2) :137-143)和 E2 蛋白（HCV 多蛋白的氨基酸 384-680, Martinez-Donato 等人，Mol Biotechnol, 2007, 35 (3) : 225-36)的重組變體作為在ELISA中的包被抗原或者 作為在細(xì)胞應(yīng)答測(cè)定法中用于進(jìn)行刺激的抗原，檢測(cè)了所評(píng)價(jià)的應(yīng)答。如在圖3中所看出 的，針對(duì)HCV的結(jié)構(gòu)抗原的抗體應(yīng)答在用Eql進(jìn)行免疫接種的組中是更高的（p〈0. 0001 ; Kruskal Wallis檢驗(yàn)和Dunn多重比較檢驗(yàn)），針對(duì)所有所評(píng)價(jià)的抗原。對(duì)于淋巴組織增生 性應(yīng)答（圖4)和IFNy分泌性細(xì)胞應(yīng)答（圖5)，分別看到類似的行為。另外，如在圖6中 所顯示的，用蛋白Eql進(jìn)行免疫接種的組是唯一的能夠在替代病毒攻擊模型中顯著地控制 特定的病毒血癥（用vvRE進(jìn)行攻擊）的組（p = 0· 0069，Kruskal Wallis檢驗(yàn)和Dunn多 重比較檢驗(yàn)）。
[0071] 這些結(jié)果證明了嵌合抗原Eql誘導(dǎo)針對(duì)HCV的數(shù)種抗原的特異性免疫應(yīng)答（體液 的以及細(xì)胞的）的能力，其中具有體內(nèi)功能活性，因?yàn)槠浣?jīng)證明能夠針對(duì)替代病毒攻擊模 型發(fā)揮保護(hù)作用。另外，證明了，在所述嵌合抗原中安置HCV的結(jié)構(gòu)抗原的所選擇的區(qū)域時(shí) 所采取的順序經(jīng)證明對(duì)于免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)和對(duì)于在攻擊模型中在功能上保護(hù)性的應(yīng)答的 發(fā)展來(lái)說(shuō)是關(guān)鍵性的，因?yàn)樽凅wCoql和Elql不誘導(dǎo)該類型的應(yīng)答。因此，所述表位存在于 所述嵌合抗原中