具有整合素親和性和結(jié)合能力及基質(zhì)金屬蛋白酶抑制能力的血管抑制多肽的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥物領(lǐng)域，更具體地說(shuō)，涉及具有整合素親和性和結(jié)合能力及基質(zhì)金 屬蛋白酶抑制能力的血管抑制多肽的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 關(guān)節(jié)炎、細(xì)菌引起的炎癥、腫瘤、眼科疾?。ㄈ鏏MD)均被稱為血管相關(guān)性疾病。
[0003] 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA)是臨床最常見(jiàn)的炎性關(guān)節(jié)病和主要致 殘因素之一。在全世界約為0.5%-1.0%，RA的發(fā)病率在我國(guó)約為0.4%。RA可發(fā)生于任 何年齡，隨著年齡的增長(zhǎng)，發(fā)病率也隨之增高。女性高發(fā)年齡為45-55歲，性別與RA發(fā)病關(guān) 系密切，男女之比約1: 3。RA是一種病因尚未明了的慢性全身性炎癥性疾病，以慢性、對(duì)稱 性、多滑膜關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)外病變?yōu)橹饕R床表現(xiàn)，屬于自身免疫炎性疾病?；颊叱Ｒ允植炕?腕部疼痛及腫脹（特別是腕背部的腫脹）為首發(fā)癥狀，癥狀持續(xù)不緩解，普通的對(duì)癥治療雖 可以緩解癥狀，但常常由于用藥不規(guī)則或不足量而導(dǎo)致癥狀反復(fù)。病情進(jìn)展時(shí)可以出現(xiàn)明 顯的晨僵，通常可達(dá)Ih以上，并不斷加重；同時(shí)出現(xiàn)一定的關(guān)節(jié)功能障礙。
[0004] 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全明了，其基本病理特點(diǎn)是血管炎和滑膜 炎。關(guān)節(jié)內(nèi)滑膜血管增生，形成血管翳，導(dǎo)致滑膜增厚，滲出增多，分泌多種細(xì)胞因子，侵犯 軟骨并引起骨質(zhì)損害。對(duì)其周圍的肌腔、韌帶、腱鞘以及肌肉等組織也均可侵蝕，從而影響 關(guān)節(jié)的穩(wěn)定，容易發(fā)生關(guān)節(jié)畸形而出現(xiàn)功能障礙。血管炎亦可侵犯周身各臟器組織，形成系 統(tǒng)性疾病。
[0005] 目前治療RA的藥物分為兩大類：控制癥狀藥和控制疾病藥。由于RA病因不明， 故當(dāng)今并無(wú)堪稱控制疾病的藥?？刂瓢Y狀的抗風(fēng)濕藥分為四類：一、非留體類抗炎藥，通常 稱為一線藥，這類藥物種類繁多，國(guó)內(nèi)市場(chǎng)已多達(dá)數(shù)十種。二、類固醇激素，激素是一個(gè)非常 好的止痛抗炎藥，但長(zhǎng)期單獨(dú)使用不能改善病情，反而帶來(lái)許多副作用，激素作為二線慢作 用藥起效前的過(guò)渡性用是可以的，但用量要小，時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。在病情較重，伴有關(guān)節(jié)外表 現(xiàn)的患者，短期治療沖擊，并聯(lián)合二線藥治療時(shí)必須的。三、慢作用抗風(fēng)濕藥，通常稱為二線 藥，所謂慢作用藥包括抗瘧藥、金鹽、青霉胺和柳氮碘胺吡啶，它們治療RA起效慢，長(zhǎng)期作 用對(duì)RA病情有一定緩解作用，故也稱病情改善藥。四、免疫抑制劑：常用有甲氨喋呤、環(huán)磷 酰胺、硫唑嘌呤、雷公藤、青風(fēng)藤等。
[0006] RA的病理過(guò)程中，血管新生是一種標(biāo)志性的組織學(xué)改變，新生血管形成伴隨滑膜 增生和炎細(xì)胞浸潤(rùn)，是RA中血管翳形成及關(guān)節(jié)破壞的基礎(chǔ)。原來(lái)應(yīng)該沒(méi)有血管存在的關(guān)節(jié) 軟骨因某種異常變化，而形成新的血管，使得軟骨受到侵蝕，造成關(guān)節(jié)變形或疼痛。新生血 管引起類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者滑膜組織發(fā)生異常變化，正常人的關(guān)節(jié)滑膜內(nèi)層僅1-2層細(xì)胞組 成，而RA患者的滑膜內(nèi)層通常有4-10層細(xì)胞（有時(shí)甚至超過(guò)20層）。這些細(xì)胞不僅在數(shù) 量上異常增多，而且在功能上處于異?；钴S的狀態(tài)，它們可以分泌大量的細(xì)胞因子、信號(hào)分 子和蛋白酶，加速關(guān)節(jié)破壞的進(jìn)程。另外，RA滑膜中還有大量炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，如T細(xì)胞、B 細(xì)胞和單核細(xì)胞。
[0007] 此外，腫瘤、眼病、炎癥都是與血管相關(guān)的疾病。腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴新生血管； 眼科疾病如年齡相關(guān)性黃斑變性（AMD)主要表現(xiàn)是脈絡(luò)膜新生血管的生成；炎癥與血管新 生是兩個(gè)相互聯(lián)系，共同發(fā)展的病理過(guò)程。
[0008] 新生血管生成，在正常生理?xiàng)l件下，受到高度調(diào)節(jié)，在生殖、胚胎發(fā)育、組織修復(fù)和 創(chuàng)傷愈合中是必不可少的過(guò)程。血管生成在多種病理?xiàng)l件下也會(huì)發(fā)生，所述病理?xiàng)l件包括： 腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移；炎性障礙，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀肩病、骨關(guān)節(jié)炎、炎性腸病、克隆病、潰 瘍性結(jié)腸類以及其它炎性障礙。
[0009] 整合素是一類廣泛分布于細(xì)胞表面的受體，能介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)及細(xì)胞與 細(xì)胞之間的相互黏附，它們通過(guò)連接胞內(nèi)細(xì)胞骨架蛋白和細(xì)胞外基質(zhì)分子的相互作用參 與血管生成。目前至少有8種的整合素（aji、aji、aji、aji、α 6β4、aji、 ανβ3、ανβ5)參與血管生成，其中ανβ3發(fā)揮著重要作用。ανβ 3能識(shí)別配體分子中的 精-甘-天冬序列（arg-gly-asp，RGD)。ανβ3可以表達(dá)于多種細(xì)胞類型，并與多細(xì)胞活 動(dòng)過(guò)程中的多種配體結(jié)合參與腫瘤的血管生成、侵襲、轉(zhuǎn)移、炎癥、傷口愈合和凝血等生理 和病理過(guò)程。因此，血管抑制多肽通過(guò)抑制血管生成可阻止向滑膜輸送氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，且 直接導(dǎo)致血管退化，從而可能抑制RA滑膜增生。抑制新生血管的形成是治療這類疾病的關(guān) 鍵，而內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和迀移是新生血管形成的關(guān)鍵步驟。
[0010] 基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs)是一類能夠聯(lián)合降解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白質(zhì)家族，目前已 發(fā)現(xiàn)20多種。生理狀態(tài)下，MMPs在組織中降解和修復(fù)細(xì)胞外基質(zhì)。在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 (RA)以及腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中，一系列細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子以及激素水平的變化引起MMPs水平 升高，使得細(xì)胞外基質(zhì)成分發(fā)生不可逆降解及關(guān)節(jié)破壞。因此，通過(guò)抑制MMPs可阻止細(xì)胞 外基質(zhì)的降解、關(guān)節(jié)破壞以及腫瘤轉(zhuǎn)移。
[0011] 經(jīng)過(guò)專利檢索，中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?01110182757. 3公開(kāi)了基質(zhì)金屬蛋白酶-9多肽 抑制劑4及其應(yīng)用，該專利中公開(kāi)多肽序列Pro- (D-Pyr) - (D-Cys) -Bip-Arg-Gly-Glu，對(duì)其 抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-9和腫瘤壞死因子釋放酶以及減輕急性炎癥反應(yīng)對(duì)機(jī)體破壞的功能 進(jìn)行了初步研宄，但是該發(fā)明公開(kāi)的序列藥效差，對(duì)人體有很強(qiáng)的毒副作用，無(wú)法直接用于 臨床應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 1.要解決的問(wèn)題
[0013] 針對(duì)現(xiàn)有治療關(guān)節(jié)炎、細(xì)菌引起的炎癥、腫瘤、眼科疾病等血管相關(guān)性疾病時(shí)藥物 靶向作用差、治療效果不佳等問(wèn)題，本發(fā)明提供一種具有整合素親和性和結(jié)合能力及基質(zhì) 金屬蛋白酶抑制能力的血管抑制多肽，其對(duì)血管以及包括關(guān)節(jié)炎、炎癥、腫瘤、眼科疾病等 炎癥相關(guān)疾病具有很好預(yù)防和治療作用，增加了其適應(yīng)癥范圍。
[0014] 2.技術(shù)方案
[0015] 為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：
[0016] 具有整合素親和性和結(jié)合能力及基質(zhì)金屬蛋白酶抑制能力的血管抑制多肽的應(yīng) 用。
[0017] 優(yōu)選地，所述的阻斷劑為多肽 I :Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly-Pr〇-(D-Pyr)-( D-Cys)-Bip-Arg-Gly-Glu 和多肽 II :Pr〇-(D-Pyr)-(D-Cys) -Bip-Arg-Gly-Glu-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp兩種；其中，Pyr為3-(3-吡啶基）-L-丙氨酸，Bip為L(zhǎng)-4, 4' -聯(lián)苯 丙氨酸，D-Pyr是D型吡啶丙氨酸，D-Cys是D-型半胱氨酸。
[0018] 優(yōu)選地，用于治療與血管新生及炎癥相關(guān)疾病，包括關(guān)節(jié)炎的預(yù)防和治療、炎癥治 療、腫瘤治療、眼科疾病的治療。
[0019] 優(yōu)選地，所述的關(guān)節(jié)炎為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、 銀肩病關(guān)節(jié)炎、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、感染性關(guān)節(jié)炎和創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎。
[0020] 優(yōu)選地，所述的炎癥為急性炎癥、亞急性炎癥和慢性炎癥。
[0021] 優(yōu)選地，所述的急性炎癥為漿液炎癥、纖維素炎癥、化膿炎癥和出血炎癥，所述的 亞急性炎癥為肉芽腫性炎癥。
[0022] 優(yōu)選地，所述的腫瘤為胃癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、膠質(zhì)瘤、黑色素瘤、宮頸 癌、卵巢癌和前列腺癌。
[0023] 優(yōu)選地，所述的眼科疾病為虹膜新生血管性眼病、脈絡(luò)膜新生血管性眼病、視網(wǎng)膜 新生血管性眼病或角膜新生血管性眼病。
[0024] 優(yōu)選地，所述的虹膜新生血管性眼病為新生血管性青光眼、糖尿病視網(wǎng)膜病變或 視網(wǎng)膜中央靜脈栓塞引起的虹膜新生血管性眼?。凰龅拿}絡(luò)膜新生血管性眼病為年齡相 關(guān)性黃斑變性、中心性滲出性視網(wǎng)膜脈絡(luò)炎、眼組織胞漿菌病綜合征或葡行性脈絡(luò)膜病變 脈絡(luò)膜新生血管性眼?。凰龅囊暰W(wǎng)膜新生血管性眼病為糖尿病、腫瘤、視網(wǎng)膜脫落、視網(wǎng) 膜中央靜脈阻塞、視網(wǎng)膜靜脈周圍炎、全身性紅斑狼瘡、Eales病或Coat病相關(guān)的視網(wǎng)膜新 生血管性眼??；所述的角膜新生血管性眼病為角膜接觸鏡所致角膜新生血管性疾病，以及 堿及其他化學(xué)物質(zhì)燒傷、角膜手術(shù)、細(xì)菌感染、衣原體感染、病毒感染或原蟲(chóng)感染引起的角 膜新生血管性眼病。
[0025] 上述的具有整合素親和性和結(jié)合能力及基質(zhì)金屬蛋白酶抑制能力的血管抑制多 肽I的制備方法，其步驟為：
[0026] (a)膨脹：稱取王樹(shù)脂13g，倒入IL的玻璃砂芯反應(yīng)柱中，加入CH2Cl 2130mL使樹(shù)脂 充分膨脹；
[0027] (b)脫帽：在步驟（a)的玻璃砂芯反應(yīng)柱中加入25mL脫帽液，密封后放入振蕩器 中反應(yīng)5min，溫度控制在室溫，反應(yīng)結(jié)束后將脫帽液抽干，用DMF洗滌一次，再次抽干后加 入25mL脫帽液（按體積比計(jì)，六氫吡啶：DMF = 4:1)反應(yīng)15min ;
[0028] (c)縮合：稱取磷酰酪氨酸保護(hù)基L Og和HOBt 2. 790g，溶于15mL DMF和3. 215mL Ν，Ν' -二異丙基碳二亞胺，然后倒入反應(yīng)釜中反應(yīng)I. 5h，溫度控制在34°C ;
[0029] (d)洗滌：將步驟（c)中縮合反應(yīng)的反應(yīng)液抽干，用DMF洗滌樹(shù)脂3次，抽干，取20 顆樹(shù)脂在小試管內(nèi)，加入二氫茚三酮驗(yàn)色劑，若為無(wú)色，說(shuō)明氨基完全結(jié)合；若為藍(lán)色，說(shuō)明 氨基未完全結(jié)合，則從步驟（b)開(kāi)始重新合成，在115°C條件下加熱3-5min，其中二氫茚三 酮驗(yàn)色劑由A液、B液和C液按體積比4:3:3混合組成，A液為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%的苯酚乙醇 溶液，B液為重蒸后的吡啶，C液為5g茚三酮溶于IOOmL無(wú)水乙醇中得到；
[0030] (e)切肽：將步驟⑷中抽干的樹(shù)脂裝入500mL的圓底燒瓶中，加入切割液密 封反應(yīng)2h，反應(yīng)結(jié)束后用砂芯漏斗將樹(shù)脂與多肽分離，得到多肽切割液，所述的切割液由 TFA(三氟乙酸）、苯酚、水、苯甲硫醚和EDT按體積比（88-92) : (2. 5-3. 53) : (2. 5-3. 5) : (1. 5-2. 5) : (I. 5-2. 5)組成；
[0031] (f)后處理：加無(wú)水乙醚到步驟（e)得到的多肽切割液中，離心后去除上清液，然 后再用無(wú)水乙醚洗絳多肽6次，抽干得多肽I粗品8. 6g ;
[0032] (g) -次純化：用純化水將步驟（f)中得到的多肽I粗品配置成10g/L的溶液，超 聲攪拌至無(wú)顆粒狀澄清溶液，用沙芯過(guò)濾器〇. 45 μ m的混合濾膜過(guò)濾得到多肽I溶液；用 制備柱分離純化得到的多肽I溶液，制備柱先用乙腈-三氟乙酸水溶液平衡lOmin，其中乙 腈、三氟乙酸和水的體積比為12:0. 1:88,流速為60mL/min，平衡結(jié)束后上樣，流速為60mL/ min，采集基線，上樣結(jié)束后按照表1中的條件對(duì)制備柱中的多肽I粗品進(jìn)行洗脫，收取在紫 外波長(zhǎng)220nm處吸收大于200mv的溶液，檢測(cè)純度大于95%的溶液合并作為多肽I的一次 純化溶液；<