br>[0033] 表1.洗脫條件
【主權項】
1. 具有整合素親和性和結(jié)合能力及基質(zhì)金屬蛋白酶抑制能力的血管抑制多肽的應用。
2. 根據(jù)權利要求1所述的具有整合素親和性和結(jié)合能力及基質(zhì)金屬蛋白酶抑制能力 的血管抑制多肽的應用，其特征在于：所述的阻斷劑為多肽1:4找-617-48口-617-617_617-Gly-Pr〇-(D_Pyr)-(D_Cys)-Bip-Arg-Gly-Glu和多肽II:Pr〇-(D_Pyr)-(D_Cys)-Bip-Arg-Gly-Glu-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp兩種。
3. 根據(jù)權利要求2所述的具有整合素親和性和結(jié)合能力及基質(zhì)金屬蛋白酶抑制能力 的血管抑制多肽的應用，其特征在于：用于治療與血管新生及炎癥相關疾病，包括關節(jié)炎的 預防和治療、炎癥治療、腫瘤治療、眼科疾病的治療。
4. 根據(jù)權利要求3所述的具有整合素親和性和結(jié)合能力及基質(zhì)金屬蛋白酶抑制能力 的血管抑制多肽的應用，其特征在于：所述的關節(jié)炎為類風濕關節(jié)炎、骨關節(jié)炎、痛風性關 節(jié)炎、強直性脊柱炎、銀肩病關節(jié)炎、反應性關節(jié)炎、感染性關節(jié)炎和創(chuàng)傷性關節(jié)炎。
5. 根據(jù)權利要求3所述的具有整合素親和性和結(jié)合能力及基質(zhì)金屬蛋白酶抑制能力 的血管抑制多肽的應用，其特征在于：所述的炎癥為急性炎癥、亞急性炎癥和慢性炎癥。
6. 根據(jù)權利要求5所述的具有整合素親和性和結(jié)合能力及基質(zhì)金屬蛋白酶抑制能力 的血管抑制多肽的應用，其特征在于：所述的急性炎癥為漿液炎癥、纖維素炎癥、化膿炎癥 和出血炎癥，所述的亞急性炎癥為肉芽腫性炎癥。
7. 根據(jù)權利要求3所述的具有整合素親和性和結(jié)合能力及基質(zhì)金屬蛋白酶抑制能力 的血管抑制多肽的應用，其特征在于：所述的腫瘤為胃癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、膠質(zhì) 瘤、黑色素瘤、宮頸癌、卵巢癌和前列腺癌。
8. 根據(jù)權利要求3所述的具有整合素親和性和結(jié)合能力及基質(zhì)金屬蛋白酶抑制能力 的血管抑制多肽的應用，其特征在于：所述的眼科疾病為虹膜新生血管性眼病、脈絡膜新生 血管性眼病、視網(wǎng)膜新生血管性眼病或角膜新生血管性眼病。
9. 根據(jù)權利要求8所述的具有整合素親和性和結(jié)合能力及基質(zhì)金屬蛋白酶抑制能力 的血管抑制多肽的應用，其特征在于：所述的虹膜新生血管性眼病為新生血管性青光眼、糖 尿病視網(wǎng)膜病變或視網(wǎng)膜中央靜脈栓塞引起的虹膜新生血管性眼??；所述的脈絡膜新生血 管性眼病為年齡相關性黃斑變性、中心性滲出性視網(wǎng)膜脈絡炎、眼組織胞漿菌病綜合征或 葡行性脈絡膜病變脈絡膜新生血管性眼??；所述的視網(wǎng)膜新生血管性眼病為糖尿病、腫瘤、 視網(wǎng)膜脫落、視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞、視網(wǎng)膜靜脈周圍炎、全身性紅斑狼瘡、Eales病或Coat 病相關的視網(wǎng)膜新生血管性眼?。凰龅慕悄ば律苄匝鄄榻悄そ佑|鏡所致角膜新生 血管性疾病，以及堿及其他化學物質(zhì)燒傷、角膜手術、細菌感染、衣原體感染、病毒感染或原 蟲感染引起的角膜新生血管性眼病。
10. 權利要求2中具有整合素親和性和結(jié)合能力及基質(zhì)金屬蛋白酶抑制能力的血管抑 制多肽I的制備方法，其步驟為： (a) 膨脹：稱取王樹脂13g，倒入1L的玻璃砂芯反應柱中，加入CH2Cl2130mL使樹脂充分 膨脹； (b) 脫帽：在步驟（a)的玻璃砂芯反應柱中加入25mL脫帽液，密封后放入振蕩器中 反應5min，溫度控制在室溫，反應結(jié)束后將脫帽液抽干，用DMF洗滌一次，再次抽干后加入 25mL脫帽液反應15min，其中，脫帽液由六氫吡啶與DMF按體積比4:1混合組成； (c) 縮合：稱取磷酰酪氨酸保護基1. 0g和HOBt2. 790g，溶于15mLDMF和3. 215mLN， N' -二異丙基碳二亞胺，然后倒入反應釜中反應1. 5h，溫度控制在34°C; (d) 洗滌：將步驟（c)中縮合反應的反應液抽干，用DMF洗滌樹脂3次，抽干，取20顆 樹脂在小試管內(nèi)，加入二氫茚三酮驗色劑，若為無色，說明氨基完全結(jié)合；若為藍色，說明氨 基未完全結(jié)合，則從步驟（b)開始重新合成，在115°C條件下加熱3-5min，其中二氫茚三酮 驗色劑由A液、B液和C液按體積比4:3:3混合組成，A液為質(zhì)量分數(shù)為80 %的苯酚乙醇溶 液，B液為重蒸后的吡啶，C液為5g茚三酮溶于100mL無水乙醇中得到； (e) 切肽：將步驟（d)中抽干的樹脂裝入500mL的圓底燒瓶中，加入切割液密封反應 2h，反應結(jié)束后用砂芯漏斗將樹脂與多肽分離，得到多肽切割液，所述的切割液由三氟乙 酸、苯酚、水、苯甲硫醚和EDT按體積比（88-92) : (2. 5-3. 53) : (2. 5-3. 5) : (1. 5-2. 5) : (1. 5- 2. 5)組成； ⑴后處理：加無水乙醚到步驟（e)得到的多肽切割液中，離心后去除上清液，然后再 用無水乙醚洗滌多肽6次，抽干得多肽I粗品8. 6g; (g) -次純化：用純化水將步驟（f)中得到的多肽I粗品配置成l〇g/L的溶液，超聲攪 拌至無顆粒狀澄清溶液，用沙芯過濾器〇. 45ym的混合濾膜過濾得到多肽I溶液；用制備柱 分離純化得到的多肽I溶液，制備柱先用乙腈-三氟乙酸水溶液平衡lOmin，其中乙腈、三氟 乙酸和水的體積比為12:0. 1:88,流速為60mL/min，平衡結(jié)束后上樣，流速為60mL/min，采 集基線，上樣結(jié)束后按照表1中的條件對制備柱中的多肽I粗品進行洗脫，收取在紫外波長 220nm處吸收大于200mv的溶液，檢測純度大于95 %的溶液合并作為多肽I的一次純化溶 液； 表1.洗脫條件
(h) 二次純化：將步驟（g)中得到的多肽I的一次純化溶液中的有機溶劑旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)掉， 然后制備柱分離純化，制備柱用乙腈-三氟乙酸水溶液平衡lOmin，其中乙腈、三氟乙酸和 水的體積比為14:0. 1:86,流速為60mL/min，平衡結(jié)束后上樣，流速為80mL/min，采集基線， 上樣結(jié)束后按照表2中的條件對制備柱中的多肽I的一次純化溶液進行洗脫，收取在紫外 波長220nm吸收大于200mv的溶液，檢測純度大于99%的溶液合并作為多肽I的二次純化 溶液； 表2.洗脫條件
(i) 凍干：將步驟（h)中得到的多肽I的二次純化溶液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀37°C減壓濃縮，除 去殘留溶劑和注射用水，然后用0. 22ym濾膜過濾，濾液裝入凍干盤中，用冷凍干燥機進行 冷凍干燥，得到多肽I的純品。
11.權利要求2中具有整合素親和性和結(jié)合能力及基質(zhì)金屬蛋白酶抑制能力的血管抑 制多肽II的制備方法，其步驟為： (a) 膨脹：稱取王樹脂預裝樹脂14. 5g，倒入1L的玻璃砂芯反應柱中，加入CH2Cl2145mL 使樹脂充分膨脹； (b) 脫帽：在步驟（a)的玻璃砂芯反應柱中加入25mL脫帽液，密封后放入振蕩器中 反應5min，溫度控制在室溫，反應結(jié)束后將脫帽液抽干，用DMF洗滌一次，再次抽干后加入 25mL脫帽液反應15min，其中，脫帽液由六氫吡啶與DMF按體積比4:1混合組成； (c) 縮合：稱取磷酰酪氨酸保護基0? 8g和HOBt1. 820g，溶于15mLDMF和2. 098mLN， N' -二異丙基碳二亞胺，然后倒入反應釜中反應1. 5h，溫度控制在34°C; (d) 洗滌：將步驟（c)中縮合反應的反應液抽干，用DMF洗滌樹脂3次，抽干，取20顆樹 脂在小試管內(nèi)，加入二氫茚三酮驗色劑，若為無色，說明氨基完全結(jié)合；若為藍色，說明氨基 未完全結(jié)合，則從步驟（b)開始重新合成，在115°C加熱3-5min，其中二氫茚三酮驗色劑由 A液、B液和C液按體積比4:3:3混合組成，A液為質(zhì)量分數(shù)為80 %的苯酚乙醇溶液，B液為 重蒸后的吡啶，C液為5g茚三酮溶于100mL無水乙醇中得到； (e) 切肽：將步驟（d)中抽干的樹脂裝入500mL的圓底燒瓶中，加入切割液密封反應 2h，反應結(jié)束后用砂芯漏斗將樹脂與多肽分離，得到多肽切割液，所述的切割液由三氟乙 酸、苯酚、水、苯甲硫醚和EDT按體積比（88-92) : (2. 5-3. 5) : (2. 5-3. 5) : (1. 5-2. 5) : (1. 5-2 .5)組成； ⑴后處理：加無水乙醚到步驟（e)得到的多肽切割液中，離心后去除上清液，然后再 用無水乙醚洗滌多肽6次，抽干得多肽II粗品8. 3g; (g) -次純化：用純化水將步驟（f)中得到的多肽II粗品配置成l〇g/L的溶液，超聲 攪拌至無顆粒狀澄清溶液，用沙芯過濾器〇. 45ym的混合濾膜過濾得到多肽II溶液；用制 備柱分離純化得到的多肽II溶液，制備柱先用乙腈-三氟乙酸水溶液平衡lOmin，其中乙 腈、三氟乙酸和水的體積比為12:0. 1:88,流速為60mL/min，平衡結(jié)束后上樣，流速為60mL/ min，采集基線，上樣結(jié)束后按照表3中的條件對制備柱中的多肽II粗品進行洗脫，收取在 紫外波長220nm處吸收大于200mv的溶液，檢測純度大于95%的溶液合并作為多肽II的一 次純化溶液； 表3.洗脫條件
(h) 二次純化：將步驟（g)中得到的多肽II的一次純化溶液中的有機溶劑旋轉(zhuǎn)蒸發(fā) 掉，然后制備柱分離純化，制備柱用乙腈-三氟乙酸水溶液平衡l〇min，其中乙腈、三氟乙酸 和水的體積比為14:0. 1:86,流速為60mL/min，平衡結(jié)束后上樣，流速為80mL/min，采集基 線，上樣結(jié)束后按照表4中的條件對制備柱中的多肽II的一次純化溶液進行洗脫，收取在 紫外波長220nm吸收大于200mv的溶液，檢測純度大于99%的溶液合并作為多肽II的二次 純化溶液； 表4.洗脫條件
(i)凍干：將步驟（h)中得到的多肽II的二次純化溶液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀37°C減壓濃縮， 除去殘留溶劑和注射用水，然后用0. 22ym濾膜過濾，濾液裝入凍干盤中，用冷凍干燥機進 行冷凍干燥，得到多肽II的純品。
【專利摘要】本發(fā)明公開了具有整合素親和性和結(jié)合能力及基質(zhì)金屬蛋白酶抑制能力的阻斷劑的應用，屬于藥物領域。它包括修飾有整合素配體序列(Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly)的多肽I：Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly-Pro-(D-Pyr)-(D-Cys)-Bip-Arg-Gly-Glu和多肽II：Pro-(D-Pyr)-(D-Cys)-Bip-Arg-Gly-Glu-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp兩種，構建出了兩種與整合素有親和性和結(jié)合能力的血管抑制多肽。由于RGD序列的靶向性，多肽可以靶向到RA中血管翳形成過程中新生血管內(nèi)皮，抑制MMPs及新生血管形成，進而達到預防或治療血管及炎癥相關疾病的效果，可用血管及炎癥相關疾病包括關節(jié)炎的預防和治療、炎癥治療、腫瘤治療、眼科疾病的治療。
【IPC分類】A61P29-00, C07K7-08, C07K1-16, A61P19-02, C07K1-36, C07K1-34, A61P27-02, A61K38-10, A61P35-00
【公開號】CN104840941
【申請?zhí)枴緾N201510251475
【發(fā)明人】康夢實
【申請人】南京安吉生物科技有限公司
【公開日】2015年8月19日
【申請日】2015年5月15日