[0020] 在多個實施方式中，瘤形成是前列腺癌且第一和第二腫瘤抗原是不同的抗原，選 自PSCA、PSMA、CD19、CD133、巨細胞病毒（CMV)感染細胞抗原、erb-B2、KDR、間皮素、NKG2D 配體、NY-ES0-1、癌胚抗原（h5T4)、VEGF-R2和WT-1。在多個實施方式中，瘤形成是乳腺癌 且第一和第二腫瘤抗原是不同的抗原，選自HER2、MUCl、⑶44、⑶49f、EpCAM、CEA、⑶133、巨 細胞病毒（〇1^)感染細胞抗原46?-246?-404?041、6吐-82,3,4、？8?、1(01?、間皮素、疆620 配體、NY-ES0-l、癌胚抗原（h5T4)、PSCA、PSMA、VEGF-R2或WT-l。在特定實施方式中，瘤形 成是B細胞白血病且第一和第二腫瘤抗原選自CDlO和CD19。在某些實施方式中，瘤形成是 多發(fā)性骨髓瘤且第一和第二腫瘤抗原選自CD56和CD138。在多個實施方式中，瘤形成是卵 巢癌且第一和第二腫瘤抗原是不同的抗原，選自間皮素、葉酸受體_a、CD44和CD133。
[0021] 本發(fā)明提供為靶向腫瘤細胞提供T細胞的組合物和方法。本發(fā)明限定的組合物和 物品是分離的或者另外根據(jù)下面提供的實施例制備。本發(fā)明的其他特點和優(yōu)點從詳細說明 和權利要求中將是顯而易見的。
【附圖說明】
[0022] 圖IA-C是描述嵌合抗原受體（CAR)和嵌合共刺激受體（CCR)載體設計以及經由 原代人類T細胞轉導的表達的圖。（A)描述了通過將免疫球蛋白可變域的重鏈和輕鏈與CD8 跨膜域（其被融合至CD3的胞質信號轉導域）融合生成CAR。通過使用內部核糖體進入位點 (IRES)實現(xiàn)雙順反子表達，CAR表達可通過關聯(lián)dsRED熒光而很容易地被檢測（數(shù)據(jù)未示 出）。通過將scFv融合至CD28跨膜和信號轉導域 15 (其被融合至4-1BB (aka CD137)胞質信 號轉導域）而生成CCR21。CCR表達可以與hrGFP的雙順反子表達相關聯(lián)（數(shù)據(jù)未示出）?？s 寫：LTR-長末端重復；SD-剪接供體位點；SA-剪接受體位點；VH或分別為可變重域或可 變輕域；EC-胞外域；TM-跨膜域；C-胞質域；IRES-內部核糖體進入位點；dsRED-Discosoma 菌株紅色熒光蛋白，hrGFP-人重組綠色熒光蛋白。（B)描述了使用這些逆轉錄病毒載體的 原代人T細胞的代表性轉導效率。（C)描述了本研宄中用不同的多種CAR進行的CTL轉導。
[0023] 圖2A-D顯示了當結合兩個抗原時，雙受體（CAR/CCR)介導的人類T細胞激活可實 現(xiàn)強健的CTL功能、長期的增殖以及增強的腫瘤根除。（A)顯示與未轉導或經P28BB轉導的 T細胞相比，在CTL實驗中當T細胞表達⑶19特異性CAR時，表達嵌合受體的T細胞溶解 抗原陽性細胞。制圖是η >4試驗的代表，誤差條表示3個重復實驗的均值的標準差。（B) 顯示了與表達兩種或單獨表達抗原之一的人腫瘤細胞系共培養(yǎng)的T細胞在31天內的T細 胞長期增殖（絕對T細胞計數(shù)），所述T細胞不表達、表達一種或兩種嵌合受體。箭頭表示 使用經新鮮輻照的腫瘤細胞重刺激T細胞。只有在表達雙受體的T細胞遇到兩種抗原時才 觀察到強健的長期增殖。制圖是η > 4試驗的代表，誤差條表示3個重復實驗的均值的標 準差。（C)描述了腫瘤感應T(TTS)細胞的全身性腫瘤根除的效力，通過將LOX IO6的T細 胞靜脈（IV)注射到攜帶表達熒光素酶的表達CD19+PSMA+PC3人前列腺腫瘤的NSG小鼠而進 行評估。通過使用BLI每周定量測定腫瘤負荷。示出來自每組的兩只代表性小鼠的圖像， 腫瘤發(fā)光的像素強度以彩色表示。對平均腫瘤負荷進行制圖，誤差條表示來自每組6只小 鼠的均值的標準差。（D)描述了使用三腫瘤小鼠模型的DP腫瘤選擇性根除，通過皮下注射 I X IO6的PC3腫瘤細胞，每種單獨對⑶19呈陽性的細胞注射入左肋，單獨對PSMA呈陽性的 細胞注射入右肋，對CD19和PSM都呈陽性的細胞注入小鼠背部。在腫瘤注入后7天靜脈 注入表達嵌合受體的19zl或Ρ28ΒΒ或19zl+P28BB的T細胞。示出攜帶這些腫瘤的每組兩 只小鼠的代表性圖像，腫瘤發(fā)光以彩色表示。用卡鉗定量測量腫瘤，并對每個腫瘤的腫瘤體 積相對于時間作圖。誤差條表示6只小鼠的均值的標準差。用雙尾非配對t檢驗來確定統(tǒng) 計學顯著性，以比較由19zlT細胞和19zl+P28BB T細胞得到的值，p值表示為* < 0. 05或 林 < 0· Ol0
[0024] 圖3Α-Ε描述了當靶向兩種前列腺腫瘤抗原時，腫瘤感應T(tts)細胞選擇性地根除 人類前列腺腫瘤。（A)描述了對三種不同的特異于PSCA的scFv組裝到雙特異性抗體中的 評價，該雙特異性抗體還具有對CD3的特異性。將T細胞與PSCA+PC3腫瘤細胞以20:1的 比率共同培養(yǎng)且加入不同量的抗體，并測定特異性溶解。（B)描述了使用在細胞毒性測定 中表現(xiàn)出不同效力的抗PSCA scFv來產生CAR。CAR介導的表達PSCA的靶細胞的特異性裂 解證實了 LzIscFv的較弱效力：其需要50倍高的效應物：革E標比率以達到與Hzl或Mzl相 同的細胞溶解水平。（C)和（D)描述了表達PSCA和PSM的全身性前列腺腫瘤的選擇性根 除，通過用這些低效的scFv進行研宄。如圖2所示，確立腫瘤（圖5)并進行處理。14天 后，對Mzl+P28BB (圖3C)或Lzl+P28BB (圖3D)靜脈注射I. 0 X IO6的嵌合受體陽性T細胞。 示出每組兩只代表性小鼠的圖像，腫瘤發(fā)光以彩色示出（從藍色=5X IO5至紅色=2X10 7 光子）。平均腫瘤負荷通過發(fā)光而加以定量并進行制圖，誤差條表示每組5只小鼠的均值 的標準差。接受PSMA腫瘤的兩只小鼠（綠線）在49天后死亡，因此發(fā)光均值通過從56天 和63天的3個值求均值得到。圖3E :與圖2D類似，在還有PSCATSMA+和PSCA +PSM/Γ的小 鼠中，通過Lz 1+P28BB T細胞實現(xiàn)了僅對PSCA+PSM+腫瘤的選擇性抗腫瘤反應。用雙尾非 配對t檢驗來確定統(tǒng)計學顯著性，以比較由LzlT細胞和Lzl+P28BB T細胞得到的值，p值 表示為 * < 0· 05 或 ** < 0· 01。
[0025] 圖4A-D描述了當在DP腫瘤上共培養(yǎng)時，發(fā)現(xiàn)由TTS引起的增強的細胞因子分泌 和BclxL表達。（A)描述了在使用未轉導的PC3細胞（空）或⑶19+PSMA+PC3細胞進行第一 抗原刺激之后48小時對未轉導T細胞或用19zl、P28BB或二者進行轉導的T細胞的多重細 胞因子分析。誤差條代表2個生物學復制品的均值的標準差。（B-D)描述了對未轉導T細 胞、或者用 Hzl (B) ;Mzl (C)和 Lzl (D)轉導的 T 細胞（抗 PSCA CAR、P28BB CAR 或 CAR+CCR 二者）的多重細胞因子分析，示出在用空白或用PSCA+PSMA+PC3細胞進行第二抗原刺激后 48小時的結果。（E)描述了在初始抗原刺激后的24小時后，使用未轉導T細胞或用19zl、 P28BB或二者進行轉導的T細胞的細胞裂解物進行的BclxL蛋白質印跡分析。Akt的總量 被用作負載對照。
[0026] 圖5描述了產生前列腺腫瘤細胞用以表達融合蛋白GFP-螢火蟲熒光素酶（GFP/ Luc)和腫瘤抗原。使用逆轉錄表達構建體，用GFP/Luc以及⑶19、PSMA、PSCA或兩種抗原 的組合對未轉導的PC3細胞（空白）進行轉導。通過對GFP/Luc、⑶19、PSM和/或PSCA 的雙提純FACS提純細胞。
[0027] 圖6A-C圖示了腫瘤感應T細胞的構思。（A)描述了表達有效CAR的TTS細胞，經 A+113+細胞有效刺激而促進針對A +細胞的免疫應答。CAR +CCR+細胞能夠結合具有提供CD3 激活信號的CAR的腫瘤抗原A+細胞。這能夠導致短期細胞溶解。CAR+CCR +細胞能夠結合具 有提供CD28和CD137信號的CCR的腫瘤抗原B+細胞。該信號單獨不足以引發(fā)細胞溶解或 增殖。只有當CAR +CCR+細胞結合具有CAR和CCR的腫瘤抗原A +B+細胞時，才能同時提供激 活和刺激。這導致強健的裂解、T細胞增殖、增強的細胞因子分泌、BclxL的上調以及在體內 選擇性根除腫瘤的能力。然而，取決于CAR的效力，這些CAR +CCR+細胞能夠潛在地再循環(huán)而 裂解單獨對CAR特異性抗