一種接種家兔用豬瘟病毒輔助液及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種接種家兔用豬瘟病毒輔助液及 其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬瘟（CSF)是國際動物衛(wèi)生組織（OIE)和中國的A類法定傳染病，是我國強(qiáng)制性免 疫的重大動物疫病之一，是危害我國養(yǎng)豬業(yè)的"第一殺手"。豬瘟是由豬瘟病毒引起的，無法 用藥物進(jìn)行控制，疫苗免疫是最有效的辦法。
[0003] 目前國內(nèi)外市售的豬瘟疫苗主要有豬瘟脾淋苗、豬瘟細(xì)胞苗以及豬瘟亞單位疫 苗，但市場上豬瘟疫苗的主流產(chǎn)品仍然是豬瘟脾淋苗和豬瘟細(xì)胞苗。作為疫苗中的經(jīng) 典-精制豬瘟脾淋源活疫苗仍具有不可替代的作用。
[0004] 豬瘟脾淋源活疫苗選用中國豬瘟兔化弱毒株（C株)，該疫苗株能激發(fā)機(jī)體快速產(chǎn) 生免疫力、遺傳穩(wěn)定、毒力不返強(qiáng)，是國際上公認(rèn)的目前世界上最為安全有效的弱毒疫苗 株。采用該毒株接種優(yōu)良家兔，收獲感染家兔的脾臟制成乳劑，與凍干保護(hù)劑混勻后經(jīng)過冷 凍真空干燥制成豬瘟脾淋源活疫苗。
[0005] 目前市場認(rèn)為豬瘟脾淋源活疫苗免疫效果不理想，對豬瘟脾淋活疫苗的認(rèn)識仍存 在誤區(qū)，這主要和目前國內(nèi)豬瘟脾淋源活疫苗使用方法不當(dāng)、混合感染豬只免疫后應(yīng)激過 大，以及質(zhì)量參差不齊等情況有關(guān)。
[0006] 氨基酸，是含有氨基和羧基的一類有機(jī)化合物的通稱。生物功能大分子蛋白質(zhì)的 基本組成單位，是構(gòu)成動物營養(yǎng)所需蛋白質(zhì)的基本物質(zhì)。維生素又名維他命，通俗來講，即 維持生命的物質(zhì)，是維持機(jī)體生命活動必須的一類有機(jī)物質(zhì)，也是保持機(jī)體健康的重要活 性物質(zhì)。維生素是機(jī)體代謝中必不可少的有機(jī)化合物。機(jī)體猶如一座極為復(fù)雜的化工廠， 不斷地進(jìn)行著各種生化反應(yīng)。其反應(yīng)與酶的催化作用有密切關(guān)系。酶要產(chǎn)生活性，必須有 輔酶參加。已知許多維生素是酶的輔酶或者是輔酶的組成分子。因此，維生素是維持和調(diào) 節(jié)機(jī)體正常代謝的重要物質(zhì)。在體內(nèi)硒和維生素 E協(xié)同，能夠保護(hù)細(xì)胞膜，防止不飽和脂肪 酸的氧化。
[0007] 多糖是中藥活性成分之一，大量研宄表明，多糖及糖復(fù)合物在生物體內(nèi)不僅是作 為能量資源和構(gòu)成材料，更重要的是它存在于一切細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)中，參與生命現(xiàn)象中細(xì)胞的 各種活動。多糖類物質(zhì)是所有生命有機(jī)體的重要組成部分，具有清除自由基、提高抗氧化酶 活性和抑制脂質(zhì)過氧化的能力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計提供一種接種家兔用豬瘟病毒 輔助液及其制備方法的技術(shù)方案。
[0009] 所述的一種接種家兔用豬瘟病毒輔助液，其特征在于每1000 ml磷酸緩沖液中含 有以下重量配比的組分：維生素組合6~10g、氨基酸組合3~5g、復(fù)方中藥多糖10~30g、 亞硒酸鈉 O~IOmg ; 所述的氨基酸組合包括蛋氨酸、賴氨酸、色氨酸、谷氨酸、甘氨酸和丙氨酸； 所述的維生素組合包括維生素 A、維生素 D、維生素 E和維生素 K ; 所述的復(fù)方中藥多糖由云芝、角叉藻、天麻、芍藥、桃仁提取得到。
[0010] 所述的一種接種家兔用豬瘟病毒輔助液，其特征在于該輔助液的PH為7. 2~7. 6。
[0011] 所述的一種接種家兔用豬瘟病毒輔助液，其特征在于所述的磷酸緩沖液由氯化 鈉6~10g，氯化鉀0. 05~0. 5g，磷酸氫二鈉1~I. 2g，磷酸二氫鉀0. 05~0. 5g，氯化鈣 0. 05~0. 2g，含6個結(jié)晶水的氯化鎂0. 05~0. 2g溶于1000 ml雙蒸水中得到。
[0012] 所述的一種接種家兔用豬瘟病毒輔助液，其特征在于所述的每1000 ml磷酸緩沖 液中含有以下重量配比的組分：維生素組合7~9g、氨基酸組合3. 5~4. 5g、復(fù)方中藥多糖 15~25g、亞硒酸鈉2~8mg。
[0013] 所述的一種接種家兔用豬瘟病毒輔助液，其特征在于所述的氨基酸組合中含有： 蛋氨酸10~15%、賴氨酸20~30%、色氨酸5~20%、谷氨酸10~30%、甘氨酸5~30%和 丙氨酸5~30%。
[0014] 所述的一種接種家兔用豬瘟病毒輔助液，其特征在于所述的氨基酸組合中含有： 蛋氨酸12~14%、賴氨酸22~26%、色氨酸10~15%、谷氨酸15~25%、甘氨酸10~20% 和丙氛酸15~25%。
[0015] 所述的一種接種家兔用豬瘟病毒輔助液，其特征在于所述的維生素組合中含有： 維生素 A 10~20%、維生素 D 15~30%和維生素 E 15~45%、維生素 K 25~60%。
[0016] 所述的一種接種家兔用豬瘟病毒輔助液，其特征在于所述的維生素組合中含有： 維生素 A 12~18%、維生素 D 20~25%和維生素 E 20~35%、維生素 K 30~40%。
[0017] 所述的一種接種家兔用豬瘟病毒輔助液，其特征在于所述的復(fù)方中藥多糖按以下 步驟制得： a、 按云芝20~40份、角叉藻10~30份、天麻10~30份、茍藥5~20份和桃仁5~ 20份稱取各中藥原料，切碎、洗凈后用冷水浸泡過夜，再加入原料重量15倍的純化水，水浴 至90°C，并保持在90°C，熬制2小時，熬制過程中每10分鐘攪拌一次； b、 棄去a中藥渣，收集藥液，室溫冷卻后經(jīng)1000 Orpm離心10分鐘，棄去沉淀，收集上 清； c、 將b中上清進(jìn)行醇沉，沉淀得到粗制中藥多糖； d、 用滅菌純化水洗滌c中粗制中藥多糖，洗滌后用20倍量的42°C滅菌純化水進(jìn)行溶 解，溶解后，按通過活性炭柱進(jìn)行內(nèi)毒素吸附，收集濾出液； e、 將d中上濾出液通過sevag法除去蛋白； f、 將e中中藥多糖進(jìn)行真空冷凍干燥制得復(fù)方中藥多糖。
[0018] 所述的一種接種家兔用豬瘟病毒輔助液的制備方法，其特征在于包括以下工藝步 驟： 1) 磷酸緩沖溶液的配制：稱取氯化鈉，氯化鉀，磷酸氫二鈉，磷酸二氫鉀，氯化鈣，含6 個結(jié)晶水的氯化鎂溶于雙蒸水中，無菌條件下通過0. 22 μ m濾膜，過濾除菌備用； 2) 復(fù)方中藥多糖的制備 a、稱取云芝份、角叉藻份、天麻份、芍藥份和桃仁份，切碎、洗凈后用冷水浸泡過夜，再 加入原料重量15倍的純化水，水浴至90°C，并保持在90°C，熬制2小時，熬制過程中每10 分鐘攪拌一次； b、 棄去a中藥渣，收集藥液，室溫冷卻后經(jīng)1000 Orpm離心10分鐘，棄去沉淀，收集上 清； c、 將b中上清進(jìn)行醇沉，沉淀得到粗制中藥多糖； d、 用滅菌純化水洗滌c中粗制中藥多糖，洗滌后用20倍量的42°C滅菌純化水進(jìn)行溶 解，溶解后，按通過活性炭柱進(jìn)行內(nèi)毒素吸附，收集濾出液； e、 將d中上濾出液通過sevag法除去蛋白； f、 將e中中藥多糖進(jìn)行真空冷凍干燥制得復(fù)方中藥多糖； 3)接種家兔用病毒輔助液配制：按比例稱取氨基酸組合、維生素組合、復(fù)方中藥多糖和 亞硒酸鈉，溶解于步驟1)制得的磷酸緩沖溶液中，充分混勻，用酸或堿調(diào)節(jié)pH至7. 2~7. 6 之間，無菌條件下通過0. 22 μ m濾膜，過濾除菌后置4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0019] 本發(fā)明具有積極有益的效果： (1)本發(fā)明所制備的輔助液，在接種家兔時能夠?qū)⒉《舅椭烈赘衅鞴?，減少接種損失， 提尚接種成功率。
[0020] (2)本發(fā)明所制備的輔助液，接種家兔，可提高家兔感染的穩(wěn)定性，減少了批次間 差異，確保成品疫苗批次間穩(wěn)定性，提高了疫苗質(zhì)量。
[0021] (3)本發(fā)明所制備的輔助液接種家兔后，可特異性的提高豬瘟病毒在家兔體內(nèi)的 增殖密度，比現(xiàn)有技術(shù)相比提高了病毒滴度5~10倍。
[0022] (4)本發(fā)明所制備的輔助液，接種家兔后發(fā)現(xiàn)所收獲的脾臟重量稍有增加，與現(xiàn)有 技術(shù)相比，所獲得的脾臟重量增加了 15%~40%。
【具體實施方式】
[0023] 為了使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解， 這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0024] 實施例1 一種接種家兔用豬瘟病毒輔助液，該病毒稀釋液每1000 ml磷酸緩沖液中含有：氨基酸 組合3g (其中蛋氨酸0. 3g、賴氨酸0. 6g、色氨酸0. 5g、谷氨酸0. 6g、甘氨酸0. 6g和丙氨酸 0. 4g)、維生素組合6g(其中維生素 A 1.2g、維生素 D 1.6g和維生素 E 1.4g、維生素 K 1.8)、 復(fù)方中藥多糖l〇g、亞硒酸鈉3mg，該輔助液pH為7. 4。
[0025] -種接種家兔用豬瘟病毒輔助液的制備方法，其步驟是： (1)磷酸緩沖溶液的配制：按上述磷酸鹽緩沖液配方準(zhǔn)確稱取氯化鈉8g，氯化鉀0. 2g， 磷酸氫二鈉 I. 15g，磷酸二氫鉀0. 2g，氯化鈣0. lg，含6個結(jié)晶水的氯化鎂0.1 g溶于1000ml 雙蒸水中，無菌條件下通過〇. 22 μ m濾膜，過濾除菌備用。
[0026] (2)復(fù)方中藥多糖的制備 a、按比例稱取云芝30份、角叉藻20份、天麻20份、芍藥10份和桃仁15份，切碎、洗凈 后用冷水浸泡過夜，再加入原料重量15倍的純化水，水浴至90°C，并保持在90°C，熬制2小 時，熬制過程中每10分鐘攪拌一次。
[0027] b、棄去a中藥渣，收集藥液，室溫冷卻后經(jīng)1000 Orpm離心10分鐘，棄去沉淀，收集 上清。
[0028] c、采用公知的醇沉法，將b中上清進(jìn)行醇沉，沉淀為粗制中藥多糖。
[0029] d、用滅菌純化水洗滌c中粗制中藥多糖，洗滌后用20倍量的42°C滅菌純化水進(jìn)行 溶解，溶解后，按通過活性炭柱進(jìn)行內(nèi)毒素吸附，收集濾出液； e、 將d中上濾出液通過sevag法除去蛋白； f、 將e中中藥多糖進(jìn)行真空冷凍干燥制得復(fù)方中藥多糖； (3)接種家兔用病毒稀釋液配制：按上述優(yōu)選稀釋液組分?jǐn)?shù)準(zhǔn)確稱取蛋氨酸0. 3g、賴 氨酸0. 6g、色氨酸0. 5g、谷氨酸0. 6g、甘氨酸0. 6g和丙氨酸0. 4g、維生素 A I. 2g、維生素 D 1.6g和維生素 E 1.4g、維生素 K 1.8、復(fù)方中藥多糖10g、亞硒酸鈉3mg、按比例溶解于步 驟（1)中的1000 ml磷