一種載藥納米脂質(zhì)體、制備方法及用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】 [0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明公開了一種共載PEG-C16-ceramide和阿 霉素的納米脂質(zhì)體及其制備方法，及其在腫瘤治療領(lǐng)域的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 多藥耐藥（multidrug resistance，MDR)，是指由一種化療藥物誘發(fā)，同時(shí)對(duì)其他作 用機(jī)理不同的多種抗腫瘤藥物均具有耐藥性的耐藥現(xiàn)象，成為臨床上導(dǎo)致化療失敗和 腫瘤復(fù)發(fā)的重要原因。多藥耐藥的形成機(jī)制復(fù)雜，影響因素眾多，涉及了細(xì)胞膜、細(xì)胞 質(zhì)到細(xì)胞核的多個(gè)方面，而且這些影響因素可能聯(lián)合在多藥耐藥的形成中起作用。據(jù) 文獻(xiàn)報(bào)道，腫瘤細(xì)胞內(nèi)ceramide含量的下降是腫瘤細(xì)胞耐藥的一個(gè)重要機(jī)制（J. Liu. Foroozesh. A review of ceramide analogs as potential anticancer agents. Future Med Chem，2013,5(12):1405-1421; N. Bartke. Hannun. Bioactive sphingolipids: metabolism and function. J Lipid Res，2009, 50 Suppl(S91-S96))。
[0003] Ceramide，作為鞘磷脂代謝的分子核心，是具有細(xì)胞毒性的脂質(zhì)成分。Ceramide在 細(xì)胞內(nèi)的來源途徑主要有三條：從頭合成途徑，鞘磷脂酶途徑，外源性ceramide的重循環(huán) 再利用途徑（N. Bartke. Hannun. Bioactive sphingolipids: metabolism and function. J Lipid Res, 2009, 50 Suppl (S91-S96))。多種化療藥物，包括阿霉素（ADR)可以通過從頭 合成途徑或者鞘磷脂酶途徑增加 ceramide,從而引起胞內(nèi)ceramide的聚集。由于ceramide 的增加而產(chǎn)生ADR誘導(dǎo)的毒性反應(yīng)。
[0004] 細(xì)胞內(nèi)ceramide含量的下降是由于ceramide降解酶如糖基化ceramide合酶 (GCS)的過表達(dá)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)的抑制。糖基化ceramide合酶（GCS)的功能是催化ceramide 轉(zhuǎn)變?yōu)镚luCer，降低了細(xì)胞內(nèi)ceramide的含量。與對(duì)應(yīng)的腫瘤敏感細(xì)胞株相比較，在多種 耐藥細(xì)胞株上過表達(dá)GCS蛋白，胞內(nèi)ceramide下降，這可以限制ceramide相關(guān)毒性反應(yīng)的 發(fā)生。
[0005] Ceramide激活化療藥物引起的細(xì)胞死亡信號(hào)中占據(jù)重要地位，胞內(nèi)ceramide含 量的下降使得化療藥物的毒性反應(yīng)下降，ceramide的降解被抑制后使得化療藥物的毒性反 應(yīng)增加。因此，外源性ceramide與化療藥物聯(lián)合給藥可能為克服MDR增加可能性，帶來新 的希望。
[0006] 目前一些研究已經(jīng)利用ceramide和化療藥物聯(lián)合給藥來克服卵巢癌MDR (van Vlerken LEL Modulation of intracellular ceramide using polymeric nanoparticles to overcome multidrug resistance in cancer. Cancer Res，2007,67(10):4843-4850 ; Devalapally HI. Paclitaxel and ceramide co-administration in biodegradable polymeric nanoparticulate delivery system to overcome drug resistance in ovarian cancer. Int J Cancer·，2007, 121 (8): 1830-1838)。在這些聯(lián)合給藥的治療中， ceramide和化療藥物均以單獨(dú)的形式。單藥的給藥形式簡(jiǎn)單而且便利，而共載的方式即 兩種藥物在同一納米藥物中比如納米脂質(zhì)體更容易吸收。與單獨(dú)的給藥形式相比較，本發(fā) 明中的ceramide和化療藥物ADR共載的治療方式具備兩方面的優(yōu)勢(shì)。首先，通過一種納 米藥物共載兩種藥物，MDR細(xì)胞可以同時(shí)得到兩種藥物的處理。這是由于通過兩種單獨(dú)的 納米藥物處理可能會(huì)引起MDR細(xì)胞對(duì)兩種藥物暴露異質(zhì)性，從而降低了聯(lián)合給藥對(duì)MDR細(xì) 胞的治療效果。其次，共載的治療策略降低了兩種單獨(dú)納米藥物藥物動(dòng)力學(xué)的相互不良作 用。因此，本發(fā)明中，利用納米藥物共載ceramide和化療藥物是克服MDR的一條有前景 的月中瘤治療途徑。（Devalapally HI. Paclitaxel and ceramide co-administration in biodegradable polymeric nanoparticulate delivery system to overcome drug resistance in ovarian cancer. Int J Cancer.，2007, 121 (8):1830-1838) 納米載藥系統(tǒng)的應(yīng)用是腫瘤治療的一項(xiàng)重要突破，其中納米脂質(zhì)體由于具備良好 的生物相容性，良好的藥物動(dòng)力學(xué)特征和長(zhǎng)循環(huán)時(shí)間而得到廣泛的應(yīng)用，而且已有脂 質(zhì)體類型的化療藥物得到了 FDA的批準(zhǔn)在臨床使用，如阿霉素脂質(zhì)體（Doxorubicin Liposomal,商品名為Doxil)以及枸櫞酸柔紅霉素脂質(zhì)體（DaunoXome)。攜載ceramide 的納米脂質(zhì)體已經(jīng)被證實(shí)了單獨(dú)或者聯(lián)合其他的化療藥物給藥均是一個(gè)有前景的腫瘤治 療手段，包括 MDR 腫瘤的克服（Ε· V. Diatlovitskaia. [Sphingolipids and cancer]· Bioorg Khim, 1998, 24(10):723-730 ；L. Brizuela, 0. Cuvillier. Biochemical methods for quantifying sphingolipids: ceramide, sphingosine, sphingosine kinase-1 activity, and sphingosine-1-phosphate· Methods Mol Biol,2012, 874(1-20))〇 當(dāng) 前的石開究已經(jīng)（Khazanov El. Physicochemical and biological characterization of ceramide-containing liposomes: paving the way to ceramide therapeutic application. Langmuir. 2008 Jun 1;24(13) :6965-80.)證實(shí)了攜載 ceramide 的納米 脂質(zhì)體的物理化學(xué)特征，一些重要的發(fā)現(xiàn)如下：ceramide的頭部羥基簇修飾少，PP值大 于13,使得ceramide不容易與磷脂類分子相混合，引起了混合結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定。為克服攜 載ceramide的納米脂質(zhì)體的不穩(wěn)定性，具有錐形結(jié)構(gòu)且PP值約0.5的1，2 -二硬脂 酰-sn-甘油基-3 -磷酸乙醇胺[甲氧基(聚乙二醇）-2000] (PEG-DSPE)，被用來構(gòu)建攜 載ceramide的納米脂質(zhì)體。加入PEG-DSPE后，攜載ceramide的納米脂質(zhì)體展示了更好的 穩(wěn)定性。
[0007] 綜上所述，多種耐藥細(xì)胞內(nèi)ceramide含量下降，限制ceramide相關(guān)毒性反應(yīng)的發(fā) 生，使得化療藥物的毒性反應(yīng)下降。因此，ceramide和化療藥物聯(lián)合給藥是克服MDR的一 條有前景的腫瘤治療途徑。而當(dāng)前現(xiàn)有技術(shù)的研究中，已經(jīng)利用ceramide和化療藥物聯(lián)合 給藥來克服卵巢癌MDR(文獻(xiàn))。但是，在這些聯(lián)合給藥的治療中，ceramide和化療藥物均以 單獨(dú)的形式給藥。這種單獨(dú)的納米藥物處理可能會(huì)引起MDR細(xì)胞對(duì)兩種藥物暴露異質(zhì)性， 從而降低了聯(lián)合給藥對(duì)MDR細(xì)胞的治療效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 為解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明構(gòu)建了一種共載PEG-C16-ceramide和 阿霉素的納米脂質(zhì)體（Lipo-ADR-Cer)，充分解決了 ceramide和化療藥物分別給藥治療效 果不佳的問題，以及ceramide的納米脂質(zhì)體中ceramide不容易與磷脂類分子相混合的問 題。
[0009] 本發(fā)明公開了 ： 1、一種載藥納米脂質(zhì)體，其特征在于，所述納米脂質(zhì)體中共載Ceramide及化療藥物。 [0010] 2、如上所述的一種載藥納米脂質(zhì)體，其特征在于，所述納米脂質(zhì)體中共載的 ceramide 為經(jīng)修飾的 ceramide。
[0011] 3、如上所述的一種載藥納米脂質(zhì)體，其特征在于，所述納米脂質(zhì)體中共載的經(jīng)修 飾的 ceramide 為 PEG-C16_ceramide〇
[0012] 4、如上所述的一種載藥納米脂質(zhì)體，其特征在于，所述納米脂質(zhì)體中共載的化療 藥為阿霉素。
[0013] 5、如上述的一種載藥納米脂質(zhì)體的制備方法，包括以下步驟： a) 油相：氫化大豆卵磷脂、膽固醇、PEG2000-DSPE、PEG2000-C16-Ceramide按比例12 : 4 :1 :3進(jìn)行混合，65°C加熱溶于乙醇中，備用；水相：250nM/L的硫酸銨溶液，65°C加熱備 用； b) 油相與水相按1 :3比例進(jìn)行混合，取油相于水相液面以下緩慢加入水相，不斷進(jìn)行 磁力攪拌，獲得脂質(zhì)體后進(jìn)行200nm、100nm、50nm薄膜篩選，獲得90nm粒徑的空白脂質(zhì)體， 備用； c) 取10mg/ml的阿霉素以75 :1000的比例與空白脂質(zhì)體于65°C制備共載藥脂質(zhì)體 Lipo-ADR-Cer ； d) 以硫酸銨及HEPES溶液為透析液，進(jìn)行兩次透析，獲得共載藥脂質(zhì)體Lipo-ADR-Cer， 于4°C避光保存代用。
[0014] 6、一種載藥納米脂質(zhì)體的用途，其特征在于，用于多藥物耐藥的癌癥治療。
[0015] 7、如上所述的一種載藥納米脂質(zhì)體的用途，其特征在于，用于化療藥物阿霉素耐 藥的癌癥治療。
[0016] 8、如上所述的一種載藥納米脂質(zhì)體的用途，其特征在于，用于化療藥物阿霉素耐 藥的乳腺癌的治療。
[0017] 9、如上所述的一種載藥納米脂質(zhì)體的用途，其特征在于，用于化療藥物阿霉素耐 藥的白血病的治療。
[0018] 研究表明加入了 PEG-DSPE后的攜載ceramide的納米脂質(zhì)體再載入ADR后仍 不穩(wěn)定。基于PEG-DSPE可以穩(wěn)定納米脂質(zhì)體的考慮，我們推測(cè)ceramide PEG化后， PEG-ceramide帶來的多且明顯的頭部親水性修飾可以增加納米脂質(zhì)體的空間位阻，從而穩(wěn) 定納米脂質(zhì)體。因此，PEG-ceramide的PP值小于ceramdie，共載PEG- C16_ceramide和阿 霉素的納米脂質(zhì)體的穩(wěn)定性有望增加。由于短?；湹腜EG- ceramide (如PEG-ceramide C8)具有快速去移除的功能而且使得納米脂質(zhì)體不穩(wěn)定（Zhang YP. StabiIized plasmid-lipid particles for regional gene therapy: formu