下層溶液(有分層，且在吸取下層溶液前，槍不要按到底打盡，留一部分空氣， 這樣插到下層溶液內(nèi)后，打盡空氣再按到底，這樣可防止吸到上層染色液)，在500 nm，紫外 分光光度計（UV-2401PC)檢測。用氯仿調(diào)零，建立標準曲線。取10~20 μL脂質(zhì)體溶液，用 MilliQ水定容到0. 5 ml,加入I. I ml甲醇，0. 5 ml氯仿，潤旋15s形成單相。向單相中繼 續(xù)加入0.5 ml氯仿，0.5 ml MilliQ水，潤旋60 s，3500rpm，離心6 min形成雙相。取雙相 下層的氯仿溶液500ul，用氯仿定容到I ml,加入顯色劑Iml混合，潤旋震蕩I min。靜置分 層。取下層氯仿400ul，用氯仿調(diào)零，在紫外分光光度計讀值（500 nm)。代入標曲。
[0035] (2)實施實例2制備的阿霉素脂質(zhì)體的包封率（EE)和載藥量測量：第一步，建 立阿霉素測定的標準曲線。光譜分析：配制l〇ug/ml的阿霉素溶液（以Milli-Q水溶解)， 以Milli-Q水調(diào)零后，在200-800nm波長范圍內(nèi)通過紫外分光光度計全掃描，根據(jù)掃描 圖譜可得，阿霉素得最大吸收波長為499nm。標準曲線的繪制：配制10mg/ml的阿霉素溶 液(為阿霉素母液，4°C冰箱保存)，按照一定濃度梯度，配置不同濃度的阿霉素溶液，加入 150μ 110%Triton-X 100。通過紫外分光光度計（CARY 100)調(diào)零后，在499nm波長處讀各樣 品值。以吸光度（A)對應阿霉素的濃度（C)作圖，得到線性回歸方程。第二步，包封率（EE) 和載藥量測量。處理樣品：將150 μ 110%Triton-X 100水溶液加入0.01 ml阿霉素脂質(zhì)體溶 液中，振蕩I min破乳，用Milli-Q水補充體積至400ul。通過紫外分光光度計在499nm處讀 取吸光度值，代入阿霉素測定的標準曲線，計算阿霉素脂質(zhì)體溶液中的阿霉素濃度和質(zhì)量。 包封率（EE):EE = W包/W投* 100% (W包指包裹進入的阿霉素的質(zhì)量；W投指投入的阿霉 素的總質(zhì)量)。載藥量（Ew，亦稱載藥量drug loading): Ew = W包/W類脂* 100% (W包 指包裹進入的阿霉素的質(zhì)量；W類脂指處方類脂的總質(zhì)量；W類脂可通過Stewart法來測定 濃度)。實驗結果見表1，實驗結果展示了 Lipo-ADR-Cer脂質(zhì)體的載藥量為5. 3%±0. 003， 包封率為96. 6%±2. 1%，與Lipo-ADR脂質(zhì)體的載藥量和包封率相似。
[0036]表1. Lipo-ADR-Cer 和 Lipo-ADR 的納米表征（η = 3，X 土 SD)
(3)實施例2制備的阿霉素脂質(zhì)體的粒徑分布和Zeta電位：以1:100的體積比稀釋阿 霉素脂質(zhì)體樣品，加入樣品池。通過英國Malvern公司的激光粒徑電位分析儀測定阿霉素 脂質(zhì)體的粒徑分布和Zeta電位。每個樣品重復測定3次。實驗結果見表1，實驗結果展示了 Lipo-ADR-Cer 脂質(zhì)體的粒徑為 96. 5±5· 6, Zeta 電位為-2. 3±0· 2, PDI 值為(λ 1±0· 03， 與Lipo-ADR脂質(zhì)體的粒徑、Zeta電位和PDI值相似。
[0037] 實驗例2:Lip〇-ADR-Cer脂質(zhì)體的體外釋放過程 取Iml的實施例2的阿霉素脂質(zhì)體溶液（Lipo-ADR，Lipo-ADR-Cer)放入透析袋（MWCO) 1000)中，透析液為20ml的PBS溶液（pH 7. 4，pH 6.5)，在37°C振蕩水浴中透析。在不同時 間的點，取樣品：設置實驗時間點為2 h，4 h，8 h，12 h，I D，2 D，3 D，4 D，每個時 間點取出Iml的透析液，并同時補充Iml的透析液，以保證體系的穩(wěn)定。根據(jù)上述的阿霉素 濃度的測定過程，將不同時間點得到的透析液在499nm下通過紫外分光光度計讀值，帶入 標曲，計算得濃度和質(zhì)量。以時間點為橫軸，以各個時間點下的釋放百分比為縱軸。釋放率 =(W總 -W剩)/ W總* 100% (W總指投入阿霉素的總質(zhì)量；W剩指剩余阿霉素的總質(zhì)量)。 實驗結果見圖1，實驗結果展示了在PH 7. 4和PH 6. 5的透析環(huán)境下，本發(fā)明Lip0-ADR-Cer 和Lipo-ADR的體外釋放過程無差異，本發(fā)明Lipo-ADR-Cer在兩種PH透析環(huán)境下的釋放過 程亦無差異。
[0038] 實驗例3:Lip〇-ADR_Cer脂質(zhì)體的體外穩(wěn)定性 取Iml的實施例2制備的阿霉素脂質(zhì)體溶液（Lipo-ADR，Lipo-ADR-Cer)放入透析袋 (MWCO) 1000)中，透析液分別為500ml的PBS溶液，含10%胎牛血清的PBS溶液，100%胎牛 血清。在37°C細胞孵箱內(nèi)攪拌透析。在ld，2d，3d，4d時間點取樣品，每個時間點取出50ul 的樣品（Lipo-ADR，Lipo-ADR-Cer)，以1:100的體積比稀釋阿霉素脂質(zhì)體樣品，加入樣品 池。通過英國Malvern公司的激光粒徑電位分析儀測定阿霉素脂質(zhì)體的粒徑分布和Zeta 電位。實驗結果見圖2,實驗結果展示了在整個實驗過程中，本發(fā)明Lipo-ADR-Cer的粒徑基 本未變，且與Lipo-ADR的粒徑基本一致。
[0039] 實驗例4:Lip〇-ADR-Cer脂質(zhì)體的體外毒性實驗 通過實施例2制備阿霉素脂質(zhì)體Lipo-ADR-Cer和Lipo-ADR，測定不同給藥時間本發(fā) 明Lipo-ADR-Cer脂質(zhì)體的體外毒性。細胞株MCF-7、MCF-7-ADR、HL-60、HL-60-ADR培養(yǎng)在 16DM培養(yǎng)基（10%牛血清）中，消化對數(shù)生長期的腫瘤細胞并收集計數(shù)，以每孔5000個細 胞，IOOul培養(yǎng)基鋪入96孔板中，在7. 5%C02,37°C的細胞培養(yǎng)箱中孵育過夜。用細胞培養(yǎng) 液按濃度梯度稀釋藥液，對應孔加入不同濃度的游離的阿霉素，游離的PEG-C16-ceramid e+ 阿霉素，Lipo-ADR-Cer和Lipo-ADR，每種藥物濃度做三副孔。在7. 5%C0_2, 37°C的細胞培 養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48h和72h后，通過CCK8試劑檢測細胞存活率。以10 μ 1的CCK8試劑加 入96孔板的每孔內(nèi)，37°C孵育2小時。設置空白孔三副孔，只加同體積的cck8試劑。通過 (MULTISKAN MK3)全自動酶標儀讀值，波長為450nm，并計算細胞存活率，通過compuysn軟 件計算藥物的IC50。
[0040] 細胞生存率=(0D各濃度-OD空白孔v( OD不加藥組-OD空白孔）X 100%，三副 孔的OD求均值。計算細胞存活率和藥物的IC50。實驗結果如圖3和表2,實驗結果展示 了給藥時間為48h時，針對耐藥細胞MCF-7-ADR，Lipo-ADR的IC50是Lipo-ADR-Cer的約 2. 25倍（p < 0. 01);同時針對耐藥細胞HL-60-ADR，給藥時間為48h時，Lipo-ADR的IC50 是Lipo-ADR-Cer的約1.4倍（p < 0. 01)。給藥時間為72h時，在耐藥細胞MCF-7-ADR上， Lipo-ADR 的 IC50 是 Lipo-ADR-Cer 的約 L 68 倍（p <0· 05);在耐藥細胞 HL-60-ADR 上， Lipo-ADR的IC50是Lipo-ADR-Cer的約1. 88倍（p < 0. 01)。這表明在耐藥細胞株上，本發(fā) 明Lipo-ADR-Cer的體外細胞毒性明顯強于Lipo-ADR。然而，對于MCF-7細胞，在給藥時間 為48h和72h時，Lipo-ADR的IC50與Lipo-ADR-Cer的IC50無統(tǒng)計學差異，兩者的殺傷曲 線相似；對于HL-60細胞，在給藥時間為48h和72h時，Lipo-ADR的IC50與Lipo-ADR-Cer 的IC50無統(tǒng)計學差異，兩者的殺傷曲線相似。
[0041] 根據(jù)上述實驗結果，在兩株化療藥物耐藥細胞株（MCF-7-ADR，HL-60-ADR)上，對比 Lipo-ADR，本發(fā)明Lipo-ADR-Cer降低了阿霉素的IC50值。
[0042] 表2. Lipo-ADR-Cer脂質(zhì)體的體外毒性實驗藥物的IC50值（η = 3，X 土 SD)
實驗例5:Lip〇-ADR-Cer脂質(zhì)體的體外促凋亡實驗 通過實施例2制備阿霉素脂質(zhì)體Lipo-ADR-Cer和Lipo-ADR，測定本發(fā)明 Lipo-ADR-Cer脂質(zhì)體的體外促凋亡能力。細胞株MCF-7、MCF-7-ADR、HL-60、HL-60-ADR培 養(yǎng)在16DM培養(yǎng)基（10%牛血清）中，消化對數(shù)生長期的腫瘤細胞并收集計數(shù)，以每孔10000 個細胞鋪48孔板，每個樣品設置副孔。放入7. 5%C02,37°C的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。對應 孔加入游離的阿霉素，游離的PEG-C16-ceramide+阿霉素，Lipo-ADR-Cer和Lipo-ADR，用細 胞培養(yǎng)液稀釋，設定阿霉素終濃度為25ug/ml，每種樣品做副孔，設定空白不加藥孔。放入 7. 5%C0_2，37°C的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，消化收集細胞于流式管中（HL-60和HL-60-ADR 為半貼壁細胞不需要消化)。涌過Alexa Fluor 488 Annexin V單染測凋亡。消化后取適 當細胞數(shù)(總細胞數(shù)=5X104)加到流式管中，細胞離心1200rpmX 5 min，棄上清，冷IXPBS 溶液，2 mL/管，洗（混懸），離心 1200rpmX5 min,棄上清，IXAnnexin-Binding Buffer 重 懸細胞，100 ML/管，每管+ 5 PL Annexin V設定NEG染Annexin V孔，室溫下孵育15 min。冰上操作，輕柔加入200 PL/管IXAnnexin-Binding Buffer,盡快上機。實驗結果見 圖4,實驗結果展示了在耐藥細胞MCF-7-ADR上，Lipo-ADR-Cer的平均熒光強度是Lipo-ADR 的約1. 72倍（p < 0. 001);在耐藥細胞HL-60-ADR上，Lipo-ADR-Cer的平均熒光強度是 Lipo-ADR 的約 L 72 倍（p <0· 01 )。在 MCF-7 上，Lipo-ADR-Cer 的平均熒光強度與 Lipo-ADR 相接近；在HL-60上，Lipo-ADR-Cer的平均熒光強度與Lipo-ADR相接近。
[0043] 這表明在耐藥細胞株上，本發(fā)明Lipo-ADR-Cer的體外促凋亡能力明顯強于 Lipo-ADR ;在敏感細胞株上，Lipo-ADR-Cer的體外促凋亡能力與Lipo-ADR的相近。
[0044] 實驗例6:CFPE-labeled Lipo-Cer脂質(zhì)體的體外轉(zhuǎn)染效率實驗 通過實施例1的處方比例中加入0. 15mg的CFPE，制備CFPE標記的空白的脂質(zhì)體， CFPE-Iabeled Lipo-Cer和CFPE-Iabeled Lipo,通過流式細胞術檢測不同時間點空白脂質(zhì) 體的體外轉(zhuǎn)染效率。細胞株]\〇?-7、]\〇7-7-401?、1-60、1-60-401?培養(yǎng)在1601培養(yǎng)基（10% 牛血清）中，消化對數(shù)生長期的腫瘤細胞并收集計數(shù)，以每孔5*10000個細胞鋪48孔板，每 個樣品設置副孔。放入7. 5%C02,37°C的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。CFPE標記的空白脂