一種組織工程化人類心肌組織的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域，具體涉及一種組織工程化人類心肌組織及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]組織工程是二十一世紀(jì)興起的一門新型交叉學(xué)科，也有人稱其為再生醫(yī)學(xué)(Regenerative Medicine)。它的基本定義是:利用生物活性物質(zhì)，通過體外培養(yǎng)或構(gòu)建的方法，研宄、開發(fā)用于修復(fù)、維護(hù)、促進(jìn)人體各種組織或器官損傷后的功能和形態(tài)的生物替代物。近年來隨著組織工程的發(fā)展，其內(nèi)涵逐漸擴(kuò)大，成為再生醫(yī)學(xué)的重要手段。其核心是模擬體內(nèi)組織發(fā)生的環(huán)境，在體外培養(yǎng)細(xì)胞，構(gòu)建由細(xì)胞和生物材料組成的、具有特定功能的三維工程化組織，替代受損組織器官。目前，國(guó)內(nèi)外用于組織工程的材料有天然材料(如明膠、膠原蛋白、基質(zhì)膠或藻酸鹽)和人工合成大分子材料(如聚己內(nèi)酰胺、聚乙醇酸、聚乳酸及其共聚物)。研宄顯示，上述用于組織工程的材料存在有如下缺陷:天然材料只能形成單層心肌細(xì)胞層，力學(xué)性能差，難于滿足組織構(gòu)建的一些要求；人工合成大分子材料只能作為機(jī)械支架為細(xì)胞生長(zhǎng)提供三維空間，其降解產(chǎn)物可能會(huì)引發(fā)機(jī)體的炎癥反應(yīng)。
[0003]本申請(qǐng)的發(fā)明人，擬提供一種可用于移植的組織工程人類心肌組織，以克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，最終通過臨床轉(zhuǎn)化，為實(shí)現(xiàn)人類心血管疾病的個(gè)體化治療提供輔助。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的現(xiàn)有替代品的缺陷，提供一種功能的可用于移植的組織工程化人類心肌組織。
[0005]具體地講，本發(fā)明提供了由自然心臟基質(zhì)和多種人類細(xì)胞制備的組織工程心肌組織；該組織工程心肌組織通過臨床轉(zhuǎn)化后，可用于I)體外檢測(cè)各類藥物對(duì)人類心臟組織的毒性作用；2)治療或替代心肌梗死后的壞死心肌組織。
[0006]本發(fā)明的組織工程化人類心肌組織由去細(xì)胞化的自然心臟基質(zhì)作為支架，接種有人類的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化來源的正常心臟的各種細(xì)胞成分制成。本發(fā)明的實(shí)施例中，優(yōu)選由來源于同一人類個(gè)體的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞定向分化和純化后所得的心肌細(xì)胞和同一個(gè)體脂肪組織提取的脂肪干細(xì)胞與大鼠或豬去細(xì)胞化心臟基質(zhì)制成組織工程化人類心肌組織。
[0007]本發(fā)明構(gòu)建的組織工程化心肌組織將去細(xì)胞化的大鼠或豬的心臟為自然心臟基質(zhì)作為工程化心肌組織基質(zhì)，將去細(xì)胞化的基質(zhì)架構(gòu)后，制得不同尺寸和外形的心臟基質(zhì)片段，將人類誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞定向分化為心血管系統(tǒng)細(xì)胞和人的脂肪組織提取的脂肪干細(xì)胞與大鼠或豬心臟基質(zhì)結(jié)合培養(yǎng)，制成有功能的工程化人類心臟組織。
[0008]本發(fā)明的組織工程化人類心肌組織具有與正常人類心肌組織相似的細(xì)胞組分、細(xì)胞外基質(zhì)及生物學(xué)功能，可以進(jìn)行體外藥物的測(cè)試和篩選、初步的臨床前期小動(dòng)物的體內(nèi)移植研宄和治療療效觀察，最終為實(shí)現(xiàn)人類心血管疾病的個(gè)體化治療提供有意義的輔助。
[0009]本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案和步驟實(shí)現(xiàn)的:
[0010]A.取去細(xì)胞化得大鼠或豬心臟，獲得自然心臟基質(zhì)；
[0011]B.將去細(xì)胞化的大鼠或豬心臟基質(zhì)按需制成形狀、尺寸不同的基材；
[0012]C.體外重編程正常人類的體細(xì)胞為誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞，定向分化為該人類的心血管系統(tǒng)細(xì)胞；所述的體細(xì)胞選自皮膚細(xì)胞或血液?jiǎn)魏思?xì)胞；
[0013]D.將分化后的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來源的心肌細(xì)胞進(jìn)行純化，使其比例達(dá)到95%以上，制成種子細(xì)胞I ;
[0014]E、分離相同個(gè)體的脂肪干細(xì)胞，體外培養(yǎng)，制成種子細(xì)胞2 ；
[0015]F、將種子細(xì)胞I和種子細(xì)胞2混合后接種于去細(xì)胞化的大鼠或豬心臟基質(zhì)上，體外三維培養(yǎng)，構(gòu)建組織工程化心肌組織。
[0016]本發(fā)明中，自然心臟基質(zhì)可采用SDS、胰酶、Triton X-100依次循環(huán)灌流大鼠、豬心臟，制得去細(xì)胞化自然心臟基質(zhì)；
[0017]本發(fā)明中，按需要將制得的自然心臟基質(zhì)制成大小、形狀不同的基材；
[0018]本發(fā)明中，可采用本領(lǐng)域已知方法進(jìn)行體外重編程誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞心肌細(xì)胞的定向分化和純化以及脂肪干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)；本發(fā)明的實(shí)施例中，采用體外培養(yǎng)誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞、分化心肌細(xì)胞，具體包括:
[0019]誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞mTeSR培養(yǎng)液，37°C含5 % 二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細(xì)胞長(zhǎng)滿后，聯(lián)合運(yùn)用fct通路的促進(jìn)劑和抑制劑使其向心肌細(xì)胞分化；心肌細(xì)胞純化:分化20天后，用純化心肌細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)，得到純度較高的心肌細(xì)胞，用無鈣鎂PBS沖洗，經(jīng)胰酶消化后，加入含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化，移入離心管中，離心，棄去上清液，加入含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，混勻，計(jì)數(shù)；
[0020]脂肪干細(xì)胞的分離和培養(yǎng):將所得同一個(gè)體的脂肪組織以PBS液沖洗兩遍，剪碎，II型膠原酶37°C消化；FBS終止消化，離心，棄上清，細(xì)胞重懸于PBS中，過濾，所得濾液離心，棄上清，DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，種于培養(yǎng)皿中37°C，5% C02恒溫箱中培養(yǎng)，2_3日換一次培養(yǎng)液，直到細(xì)胞融合至60% -75%密度時(shí)傳代；
[0021]本發(fā)明中，將純化后的心肌細(xì)胞和脂肪干細(xì)胞接種到所采用的的大小、形狀不同的大鼠或豬去細(xì)胞化心臟基質(zhì)上，經(jīng)體外三維培養(yǎng)，構(gòu)建不同形狀和尺寸的組織工程化心肌組織。
[0022]本發(fā)明采用去細(xì)胞化的自然心臟基質(zhì)作為心肌組織基質(zhì)，具有良好生物相容性、力學(xué)性能和生物降解性。
[0023]所制得的組織工程化心肌組織與正常心肌組織相似，具有正常心臟的各種細(xì)胞成分、細(xì)胞外基質(zhì)及生物學(xué)活性。
[0024]經(jīng)測(cè)試，本發(fā)明制得的組織工程化人類心肌組織具有與正常人類心肌組織相似細(xì)胞成分和電生理功能，既保持一定的機(jī)械強(qiáng)度，基本力學(xué)性能，又具有合理的孔隙率，良好的細(xì)胞相容性，生物降解性，不會(huì)引起炎癥反應(yīng)，是一種可以用于移植的具有生物學(xué)活性的活組織?？蛇M(jìn)一步用于進(jìn)行體外藥物的測(cè)試和篩選，以及初步的臨床前期小動(dòng)物的體內(nèi)移植研宄和治療療效觀察，最終對(duì)實(shí)現(xiàn)人類心血管疾病的個(gè)體化治療提供有意義的輔助。
【附圖說明】
[0025]圖1，制得去細(xì)胞化大鼠心臟基質(zhì)流程圖，
[0026]其中A:灌流前；
[0027]B:灌去離子水后；
[0028]C:灌 PBS 后；
[0029]D:灌胰酶后；
[0030]E:灌SDS溶液后；
[0031]F:灌 Triton X-100 溶液后。
[0032]圖2，未處理大鼠心臟和去細(xì)胞化后大鼠心臟HE及熒光染色。
[0033]圖3，正常心臟和去細(xì)胞化心臟細(xì)胞外基質(zhì)鑒定，可見去細(xì)胞化心臟細(xì)胞外基質(zhì)保存完好。
[0034]圖4，人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化來源的心肌細(xì)胞鑒定，這些心肌細(xì)胞具有完整的纖