維結(jié)構(gòu)，表達(dá)正常心肌細(xì)胞的蛋白標(biāo)志物如cTnT，a-actinin, MLC2v等。
[0035]圖5，人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞和脂肪干細(xì)胞接種到去細(xì)胞化大鼠心臟基質(zhì)后形成的人造心肌組織的外貌(A)與HE染色觀察細(xì)胞與支架結(jié)合情況及細(xì)胞排列(B)，免疫熒光染色可觀察到心肌細(xì)胞(cTnT)與平滑肌細(xì)胞(SMA)存在于組織內(nèi)。
[0036]圖6，人造人類心肌組織有與正常心臟一致的對影響心臟收縮與節(jié)律的藥物的反應(yīng)，如圖中所示，人造人類心肌組織對正性肌力藥物去甲腎上腺素與鈣離子拮抗劑硝苯地平(Nifedipine)有與心臟一致的反應(yīng)。
【具體實(shí)施方式】
[0037]實(shí)施例1
[0038]I)自然心臟基質(zhì)的制備
[0039]按圖1所示，采用1%的SDS、0.02%胰酶+EDTA、l%Triton X-100、含雙抗的無菌PBS和滅菌水，依次循環(huán)灌流大鼠心臟，得到無菌的去細(xì)胞化自然心臟基質(zhì)(如圖2所示)；
[0040]2)將得到的自然心臟基質(zhì)按需制成Icm3大小的正方形基材；
[0041]3)體外培養(yǎng)誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞、分化心肌細(xì)胞:
[0042]誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞用專用培養(yǎng)液(購于STEMCELL Technologies公司或自配)，37°C含5% 二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細(xì)胞長滿后，聯(lián)合使用Wnt通路的促進(jìn)劑和抑制劑使其向心肌細(xì)胞分化，7天后可見跳動的心肌細(xì)胞；
[0043]4)心肌細(xì)胞純化:
[0044]分化20后，用純化心肌細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)基(不含葡萄糖含乳糖的DMEM，購于Gbico)培養(yǎng)7天，得到純度較高的心肌細(xì)胞，用無鈣鎂PBS沖洗，經(jīng)0.05%的胰酶消化后，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化，移入離心管中，600轉(zhuǎn)/分鐘離心，棄去上清液，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，混勻，計(jì)數(shù)；
[0045]進(jìn)一步對所述的心肌細(xì)胞進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示，所述的心肌細(xì)胞具有完整的纖維結(jié)構(gòu)，表達(dá)正常心肌細(xì)胞的蛋白標(biāo)志物如cTnT，a-actinin, MLC2v等(如圖4所示)；
[0046]5)脂肪干細(xì)胞的分離和培養(yǎng):
[0047]將所得脂肪組織以PBS液沖洗兩遍，剪碎，轉(zhuǎn)入廣口燒杯內(nèi)，加入等體積的0.075% II型膠原酶，置于磁力攪拌器上，125轉(zhuǎn)/分鐘，37°C消化30分鐘；FBS終止消化，1200g離心5分鐘，棄上清，細(xì)胞重懸于PBS中，10um濾器過濾，所得濾液300g離心5分鐘，棄上清，含10% FBS的DMEM(購于Gbico)培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，種于培養(yǎng)皿中37°C，5% 0)2恒溫箱中培養(yǎng)，2-3日換一次培養(yǎng)液，直至細(xì)胞融合至60% -75%密度時1:3傳代；
[0048]本發(fā)明采用的體外重編程誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞心肌細(xì)胞的定向分化和純化，脂肪干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)均按本領(lǐng)域已知方法；
[0049]6)將來源于同一個正常人的純化后心肌細(xì)胞和脂肪干細(xì)胞按9:1的比例，接種到制得的大鼠去細(xì)胞化心臟基質(zhì)上，接種密度為106/cm2，體外三維培養(yǎng)，構(gòu)建有功能的人類心肌組織(如圖3所示)；結(jié)果顯示，所形成的人造心肌組織的外貌(A)與HE染色觀察細(xì)胞與支架結(jié)合情況及細(xì)胞排列(B)，免疫熒光染色可觀察到心肌細(xì)胞(cTnT)與平滑肌細(xì)胞(SMA)存在于組織內(nèi)(如圖5所示)。
[0050]本發(fā)明上述方法制得的組織工程化人類心肌組織具有與正常人類心肌組織相似細(xì)胞成分和電生理功能，既保持一定的機(jī)械強(qiáng)度，基本力學(xué)性能，又具有合理的孔隙率，良好的細(xì)胞相容性，生物降解性，不會引起炎癥反應(yīng)，是一種可以用于移植的具有生物學(xué)活性的活組織。
[0051]實(shí)施例2
[0052]按實(shí)施例1方法制得的組織工程化人類心肌組織在體外進(jìn)行長期培養(yǎng)，利用多電極微陣列手段檢測其收縮功能和電生理功能，結(jié)果顯示其具有與正常人類心肌組織相似細(xì)胞成分和電生理功能，在該心肌組織培養(yǎng)環(huán)境中加入不同小分子化學(xué)藥物或中草藥制劑等，通過多電極微陣列系統(tǒng)檢測其收縮功能和電生理功能變化，結(jié)果顯示，可提前預(yù)測所測試小分子化學(xué)藥物或中草藥制劑在人體內(nèi)可能的對心臟組織的功能影響和毒性反應(yīng)；圖6顯示了所述的人造人類心肌組織有與正常心臟一致的對影響心臟收縮與節(jié)律的藥物的反應(yīng)，所述的人造人類心肌組織對正性肌力藥物去甲腎上腺素與鈣離子拮抗劑硝苯地平(Nifedipine)有與心臟一致的反應(yīng)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種組織工程化人類心肌組織，其特征在于，由去細(xì)胞化的自然心臟基質(zhì)作為支架和接種有人類的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化來源的正常心臟的各種細(xì)胞成分制成。2.按權(quán)利要求1所述的組織工程化人類心肌組織，其特征在于，組織工程化人類心肌組織由來源于同一人類個體的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞定向分化和純化后所得的心肌細(xì)胞和同一個體脂肪組織提取的脂肪干細(xì)胞與大鼠或豬去細(xì)胞化心臟基質(zhì)制成。3.按權(quán)利要求1所述的組織工程化人類心肌組織，其特征在于，所述的支架材料是自然心臟基質(zhì)，生物相容性好。4.制備權(quán)利要求1的組織工程化心肌組織的方法，其特征在于，其包括下述步驟: A.取去細(xì)胞化的大鼠或豬心臟，獲得自然心臟基質(zhì)； B.將去細(xì)胞化的大鼠或豬心臟基質(zhì)按需制成形狀、尺寸不同的基材； C.體外重編程正常人類的體細(xì)胞為誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞，定向分化為該人類的心血管系統(tǒng)細(xì)胞； D.將分化后的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來源的心肌細(xì)胞進(jìn)行純化，使其比例達(dá)到95%以上，制成種子細(xì)胞I ; E.分離相同個體的脂肪干細(xì)胞，體外培養(yǎng)，制成種子細(xì)胞2; F.將種子細(xì)胞I和種子細(xì)胞2混合后接種于步驟A的去細(xì)胞化的大鼠或豬心臟基質(zhì)上，體外三維培養(yǎng)，構(gòu)建得組織工程化心肌組織。5.按權(quán)利要求4的方法，其特征在于，所述步驟C的體細(xì)胞選自皮膚細(xì)胞或血液單核細(xì)胞。
【專利摘要】本發(fā)明屬生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域，涉及一種組織工程化人類心肌組織及其制備方法。本發(fā)明的組織工程化人類心肌組織由去細(xì)胞化的自然心臟基質(zhì)作為支架，接種有人類的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化來源的正常心臟的各種細(xì)胞成分制成。本組織工程化心肌組織具有與正常人類心肌組織相似的細(xì)胞組分、細(xì)胞外基質(zhì)及生物學(xué)功能，可以進(jìn)行體外藥物的測試和篩選、初步的臨床前期小動物的體內(nèi)移植研究和治療療效觀察，最終為實(shí)現(xiàn)人類心血管疾病的個體化治療提供幫助。
【IPC分類】A61L27/50, A61L27/38, A61L27/26, A61L27/58, C12N5/077
【公開號】CN104940997
【申請?zhí)枴緾N201510131273
【發(fā)明人】孫寧, 湯其群, 陳思峰, 錢睿哲, 王青潔, 楊慧, 詹永坤, 李賓
【申請人】復(fù)旦大學(xué)
【公開日】2015年9月30日
【申請日】2015年3月24日