，可以使用lmg/m2至40mg/m 2體表面積每天的劑量。以藥學(xué)可接受的鹽給 藥時(shí)，劑量可以游離堿的形式計(jì)算得出。在一些實(shí)施方式中，組合物每日給藥1至4次?？?選擇地，本發(fā)明的組合物可通過連續(xù)靜脈輸注的方式給藥，各種活性成分的劑量?jī)?yōu)選最高 至1000mg/m 2體表面積每天。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的那樣，在某些情況下，需要以超出 或者遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出上述優(yōu)選劑量范圍的量施用本文公開的化合物以有效地和積極性地治療特 別惡性的疾病或感染。在一些實(shí)施方式中，化合物將在一段連續(xù)治療的時(shí)期內(nèi)施用，例如一 周或更多，或者幾個(gè)月或幾年。
[0172] 可單獨(dú)調(diào)整給藥量和間隔以提供足以維持治療效果或最低有效濃度（MEC)的活 性部分血漿水平。每種化合物的MEC將變化，但是可根據(jù)體外數(shù)據(jù)估計(jì)。獲得MEC所需要 的劑量將取決于個(gè)體的特性和給藥途徑。無論如何，HPLC測(cè)定法或生物測(cè)定法可用于確 定血漿濃度。
[0173] 利用MEC值還可以確定給藥間隔。應(yīng)當(dāng)使用能維持血漿水平在10-90%時(shí)間高于 MEC的方案來施用組合物，通常30-90%，最通常50-90%。
[0174] 對(duì)于局部性給藥或者選擇性吸收，藥物的有效局部濃度可與血漿濃度不相關(guān)。
[0175] 所施用組合物的量取決于受治療的受試者、受試者的體重、痛苦的嚴(yán)重程度、給藥 方式和處方醫(yī)師的判斷。
[0176] 利用已知方法可以評(píng)估本文公開化合物的效能和毒性。例如，特定化合物或者共 享某些化學(xué)部分的化合物亞組的毒理學(xué)可通過測(cè)定對(duì)細(xì)胞系的體外毒性而確定，例如哺乳 動(dòng)物細(xì)胞系，優(yōu)選人細(xì)胞系。這類研宄的結(jié)果經(jīng)?？梢灶A(yù)測(cè)對(duì)動(dòng)物的毒性，例如哺乳動(dòng)物， 或更特別地，人?？蛇x擇地，可使用已知方法確定動(dòng)物模型中特定化合物的毒性，例如小鼠、 大鼠、家兔或猴子。使用幾種公認(rèn)的方法可確定特定化合物的效能，例如體外方法、動(dòng)物模 型、或人臨床試驗(yàn)。幾乎每種狀況都存在公認(rèn)的體外模型，包括但不限于癌癥、心血管疾病 和各種免疫功能異常。相似地，可接受的動(dòng)物模型可用于確定用于治療這些狀況的化學(xué)物 質(zhì)的效能。當(dāng)選擇模型來測(cè)定效能時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以受到本領(lǐng)域狀況的引導(dǎo)而選擇 適當(dāng)?shù)哪Ｐ?、劑量、和給藥途徑、和給藥方案。當(dāng)然，人臨床試驗(yàn)也可以用于測(cè)定化合物對(duì)人 類的效能。
[0177] 如果需要，本發(fā)明的組合物可存在于包裝或分配裝置中，其可包含一種或更多種 包含活性成分的單位劑量。包裝可例如包含金屬或塑料箔，例如罩泡包裝（blister pack)。 包裝或分配裝置也可附帶給藥說明書。包裝或分配裝置也可附帶連同容器的告示，該告示 以管理藥物制造、使用或銷售的政府機(jī)構(gòu)規(guī)定的形式，其中告示反應(yīng)了該機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)的人用 或獸用藥物形式。例如，這樣的告示可以是美國食品與藥品管理局對(duì)處方藥批準(zhǔn)的標(biāo)簽，或 者是批準(zhǔn)的產(chǎn)品說明書（product insert)。還可將包含本發(fā)明化合物的組合物制備到相容 的藥物載體中，放入適當(dāng)?shù)娜萜髦?，?biāo)明所治療的適應(yīng)癥。
[0178] 在整個(gè)說明書當(dāng)中，特定化合物的任何詳細(xì)描述應(yīng)當(dāng)被理解為包括該化合物和其 任何（其他）藥學(xué)可接受的鹽。
[0179] 在BER的第一步驟中，一連串的糖基化酶識(shí)別異常的堿基例如N3 mA和 N7mG(O' Connor 等人，''Isolation and structure of a cDNA expressing a mammalian 3-methyladenine-DNA glycosylase"EMBO J. 9 :3337_3342,1990 ;Samson 等人，"Cloning and characterization of a3-methyladenine DNA glycosylase cDNA from human cells whose gene maps to chromosome 16" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 :9127_9131， 1991)、T:G 錯(cuò)配(Neddermann 等人"Functional expression of soluble human interleukin-11 (IL-ll)receptor alpha and stoichiometry of in Vitro IL-llreceptor complexes with gpl30"J. Biol. Chem. 271 :12767-12774,1996)、和脫氨堿基例如次黃 嘌呤/被氧化的8-氧-7,8-二氫鳥嘌呤或尿嘧啶AWollberg等人"Isolation and characterization of the human uracil DNA glycosylase gene"Proc. Natl. Acad. Sci.USA 86:8693-8697,1989 ;01sen 等人"Molecular cloning of human uracil-DNA glycosylase，a highly conserved DNA repair enzyme"EMB0 J. 8:3121-3125,1989; Radicella 等人 "Cloning and characterization of hOGGl，a human homolog of the OGGlgene of Saccharomyces cerevisiae"Proc. Natl. Acad. Sci. USA94. 8010-8015,1997; Rosenquist 等人"Cloning and characterization of a mammalian 8-oxoguanine DNA glycosylase"Proc. Natl. Acad. Sci. USA94 :7429-7434,1997)。N-糖苷鍵經(jīng)過酶或者自然 水解和釋放異常堿基之后，AP(無嘌呤/無嘧啶）核酸內(nèi)切酶水解磷酸二酯主鏈5'導(dǎo)致 損傷，并且dRpase (-種DNA脫氧核糖磷酸二酯酶，其活性與聚合酶0相關(guān)）切除殘留的 dRp，產(chǎn)生一個(gè)核苷酸缺口。DNA聚合酶0填補(bǔ)了缺口，DNA連接酶封住切口。這個(gè)途徑稱 為短補(bǔ)綴BER。BER可替換的途徑包括DNA合成以填補(bǔ)2至13個(gè)核苷酸的缺口。該長補(bǔ)綴 修復(fù)需要增殖細(xì)胞核抗原（PCNA)和PCNA-依賴的DNA聚合酶（Wilson "Mammalian base excision repair and DNA polymerase beta"Mutation Res. 407 :203_215,1998)〇
[0180] 多-(ADP-核糖）-聚合（PARP)通過本身或與XRCC1相互作用而充當(dāng)DNA鏈 斷裂的切口傳感器，參與BER。PARP與受損的DNA結(jié)合，產(chǎn)生自動(dòng)核糖基化作用。然 后經(jīng)修飾的蛋白釋放和允許其他蛋白質(zhì)進(jìn)入并修復(fù)DNA鏈斷裂（Wilson "Mammalian base excision repair and DNA polymerase beta"Mutation Res. 407 :203_215,1998 ; Molinete 等人，"Over production of the poly (ADP-ribose)polymerase DNA-binding domain blocks alkylation-induced DNA repair synthesis in mammalian cells'^EMBO J. 12:2109-2117,1993 ;Caldecott 等人，"XRCCI polypeptide interacts with DNA polymerase and possibly poly (ADP-ribose) polymerase，and DNA ligase III is a novel molecular 'nick-sensor' in vitro"Nucleic Acids Res. 24 :4387_4394,1996) 〇 因此，切口形成之后PARP在短補(bǔ)綴和長補(bǔ)綴修復(fù)中參與BER?？雌饋鞡ER在可替代（長補(bǔ) 綴修復(fù)）途徑中最有效。圖6顯示了培美曲塞和MX的聯(lián)合增加了斷裂的PARP形成。DNA 雙鏈斷裂和凋亡的增加不依賴Bcl-2途徑。
[0181] 通常，下文使用的命名和下面描述的在細(xì)胞培養(yǎng)、組織培養(yǎng)、腫瘤生物學(xué)和分子 遺傳學(xué)方面的實(shí)驗(yàn)室操作在本領(lǐng)域中是公知和常用的。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用于細(xì)胞培養(yǎng)方 法、試驗(yàn)設(shè)計(jì)和化合物制劑及命名。根據(jù)制造商的說明書來進(jìn)行一般的化學(xué)反應(yīng)和純化 步驟。通常根據(jù)本領(lǐng)域的常規(guī)方法和各種一般性參考文獻(xiàn)來完成這些技術(shù)和操作（通 常參見 Sambrook 等人，Molecular Cloning :ALaboratory Manual，2d ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor，N. Y?，和 Current Protocols in Molecular Biology (1996) John Wiley and Sons，Inc.，N.Y.，其通過援引引入本文），這些 技術(shù)和方法遍布在該文獻(xiàn)當(dāng)中。那其中包含的所有信息通過援引引入本文。
[0182]培美曲塞（2-[4_[2_ (4_ 氛基 _2_ 氧 _3, 5, 7_ 二氣雜二環(huán)[4. 3. 0]壬 _3,8,10-二 烯-9-基）乙基]苯甲?；鵠氨基戊二酸）（ALMTA?;Eli Lilly&Co.)是具有下述結(jié)構(gòu)的 抗代謝化學(xué)治療藥物：
[0183]
[0184] 培美曲港定Jan販外_肥_反市u/yr而tw嚇ekw腳n 土機(jī)市u iiusei卞用的抗葉酸劑抗腫 瘤藥。培美曲塞抑制胸核苷酸合成酶（TS)、二氫葉酸還原酶（DHFR)和甘氨酰胺核糖核苷酸 轉(zhuǎn)甲酰酶（GARFT)、參與胸苷和嘌呤核苷酸從頭生物合成的酶。培美曲塞被FDA批準(zhǔn)用于 治療非小細(xì)胞肺癌和被批準(zhǔn)與順鉑（以鉑為基礎(chǔ)的化療藥物）聯(lián)合治療惡性胸膜間皮瘤。 治療間皮瘤（與順鉑聯(lián)用）或非小細(xì)胞肺癌的推薦劑量是約500mg/m2體表面積每天，作為 靜脈輸注劑在每個(gè)21-天周期的第一天施用超過10分鐘。對(duì)于和甲氧胺的治療聯(lián)用，培 美曲塞代表性的劑量范圍通常是200mg/m2至1，000mg/m2體表面積每天，或者500mg/m2至 600mg/m2體表面積每天；甲氧胺代表性的劑量范圍是1至200mg/m2體表面積每天，或者6 至120mg/m2體表面積每天。在一個(gè)實(shí)施方式中，培美曲塞以和如上描述相同的方式施用； 然而，靜脈輸注可進(jìn)行超過15分鐘、20分鐘、30分鐘、45分鐘、60分鐘或更長時(shí)間，并且可 在第1天進(jìn)行，加上給定周期的一個(gè)或更多個(gè)額外的天數(shù)，給定周期可以是1周、2周、3周、 1月或更長。
[0185] 實(shí)施例
[0186] 材料和方法
[0187] 化學(xué)物質(zhì)和試劑。甲氧胺（MX)購自Sigma (ST. Louis，Mo. )。MX溶于無菌水（pH 7.0)中。
[0188] 蛋白質(zhì)印跡法（Western Blotting)用于探測(cè)PARP斷裂。150V條件下在Bio-Rad 微型膠裝置中用SDS-PAGE(12%聚丙烯酰胺）溶解細(xì)胞提取物1小時(shí)。在100V條件下使用 Bio-Rad微型轉(zhuǎn)移印跡槽（mini Trans-Blot cell) 1小時(shí)，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDV膜上。用 15TBS緩沖溶液中的5%的奶粉阻斷沾上印跡的膜，然后用抗-PARP抗體C2-10 (Trevigen， Gaithersburg，Md.)探測(cè)2小時(shí)。用TBS-Tween20(0. 05% )洗滌三個(gè)5分鐘后，用第二種 抗體抗 _ 小鼠 HRP-抗 IgG 培養(yǎng)印跡 1 小時(shí)（Amersham Life Science，Arlington Height 111.)。根據(jù)制造者的說明書（Amersham Life Science，Arlington Heights，111.)用 ECL 使抗體結(jié)合顯現(xiàn)。
[0189] 裸小鼠腫瘤。將腫瘤細(xì)胞（5xl06)注射到6-8周齡的雌性無胸腺HSD裸小鼠的側(cè)腹 部。動(dòng)物接受每日5次下列腹膜內(nèi)注射：鹽水、單獨(dú)的培美曲塞（150mg/kg)、單獨(dú)的MX(4mg/ 1^)，或者培美曲塞與1乂比例為26.7:1.0的培美曲塞（15〇11^/1^)和1?(41^/1^)聯(lián)合。以 測(cè)徑器測(cè)量腫瘤，使用 National Cancer Institute 公式：V = L (mm) xl2 (mm)/2,其中 L 是 腫瘤的最大直徑，I是腫瘤的最小直徑。當(dāng)腫瘤的體積達(dá)到約100_150mm3時(shí)，荷瘤小鼠被隨 機(jī)指定用于對(duì)照組或治療組（6-9只小鼠/組）。
[0190]實(shí)施例1
[0191] 圖8顯示在人NCI-H460NSCLC細(xì)胞系模型、A549NSCLC細(xì)胞系模型、HCT116結(jié)腸癌 細(xì)胞系模型和MDA-MB-468乳腺癌細(xì)胞系模型中，所有接受甲氧胺（MX) +培美曲塞的組比單 獨(dú)接受培美曲塞的組表現(xiàn)出更強(qiáng)的腫瘤生長延遲。MX逆轉(zhuǎn)了 NCI-H460NSCLC細(xì)胞系和HCT 116結(jié)腸癌細(xì)胞系對(duì)培美曲塞化學(xué)治療效果的耐藥性。
[0192]實(shí)施例2
[0193] 為了測(cè)定培美曲塞+甲氧胺（MX)相對(duì)于單獨(dú)培美曲塞對(duì)產(chǎn)生AP位點(diǎn)數(shù)量的影 響，使用醛反應(yīng)性探針（ARP)試劑來測(cè)定由培美曲塞形成的和由MX阻斷的AP位點(diǎn)。ARP和 MX對(duì)AP位點(diǎn)具有相似的反應(yīng)性，它們尤其與醛基反應(yīng)，醛基是AP位點(diǎn)的一種開環(huán)形式。這 樣的測(cè)定發(fā)描述于 Liu 等人，（Molecular Cancer Therapeutics 2:1061-1066, 2003)中， 并基本根據(jù)Nakamura等人，（Cancer Res. 58 :222-225,1998)的描述進(jìn)行操作。用培美曲塞 (0、100、200或400 ym)處理H460細(xì)胞24小時(shí)。然后從細(xì)胞中提取DNA(15yg)，并在37°C 下用ImM ARP培養(yǎng)10分鐘。用乙醇沉淀和洗滌DNA，然后重懸于TE緩沖液（10mM Tris-HCl， pH 7. 2, ImM EDTA)中，在100°C下使之變性5分鐘。然后迅速在冰上冷凍DNA，并與等量的 醋酸銨（2M)混合。然后使用真空過濾裝置在硝酸纖維素膜上固定單鏈DNA。室溫下用抗生 蛋白鏈菌素-結(jié)合的辣根過氧化物酶培養(yǎng)該膜30分鐘，用洗滌緩沖液（20mM Tris-HCl，ImM EDTA，0. 26M NaCl，1% Tween-20)漂洗。用 ECL 試劑（Amersham，Piscataway，NJ)使 ARP-AP 位點(diǎn)顯現(xiàn)。結(jié)果顯示在4A中。100、200和400 yM劑量的培美曲塞誘導(dǎo)AP位點(diǎn)的形成，AP 位點(diǎn)誘導(dǎo)作用程度與培美曲塞劑量成比例（圖4A)。在培美曲塞中加入MX與單獨(dú)培美曲塞 相比顯著地減少了可探測(cè)AP位點(diǎn)的數(shù)量。在24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)觀察200 yM培美 曲塞和6mM MX的聯(lián)合效果。結(jié)果顯示在圖4B中。隨著時(shí)間的過去，單獨(dú)培美曲塞組和培 美曲塞與MX聯(lián)合組都減少了可探測(cè)的AP位點(diǎn)的數(shù)量。
[0194] 概括來說，培美曲塞誘導(dǎo)AP位點(diǎn)的形成，而培美曲塞和100 yM MX的聯(lián)合將可探 測(cè)AP位點(diǎn)降低到對(duì)照水平，這并不是AP位點(diǎn)缺失的原因，而是由于AP位點(diǎn)被MX所占據(jù)， 致使它們不能被APR利用。AP位點(diǎn)的占據(jù)是時(shí)間依賴性的，這表明持續(xù)的MX水平對(duì)于最大 效果來說是必需的。
[0195]實(shí)施例3
[0196] 使用DNA鏈斷裂測(cè)定法來測(cè)定培美曲塞和甲氧胺（MX)增加由細(xì)胞凋亡和DNA鏈 斷裂介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞死亡的能力。彗星分析測(cè)定法描述在Liu等人（前文）中，其基于在電 場(chǎng)影響下變性的、斷裂的DNA片段迀移出細(xì)胞的能力。當(dāng)通電流時(shí)，未受損的DNA移動(dòng)較慢， 并且其保留在細(xì)胞核區(qū)域范圍內(nèi)?；趯?duì)DNA "彗星"拖尾形狀和迀移距離的評(píng)估來評(píng)價(jià) 細(xì)胞內(nèi)DNA損傷（Helma等人，，Mutat. Res. 466 :9-15,2000)。在各自暴露于200 yM培美曲 塞、6mM MX或200 yM培美曲塞+6mM MX 4小時(shí)之后采集細(xì)胞并用PBS洗滌。在42°C下，以 1 : l〇(v/v)比例將H460細(xì)胞的混懸液（lX105/ml冷PBS)與1%低膠凝溫度瓊脂糖混合， 迅速用移液管將75 y 1轉(zhuǎn)移到彗星載玻片（CometSlide) (Trevigen，Inc.，Gaithersburg， MD)上。當(dāng)放置低膠凝溫度瓊脂糖之后，在4°C下將載玻片沉入預(yù)冷的溶胞緩沖液（lOmM Tris-HCl，pH 10. 5-11. 5,2. 5M NaCl，100mM EDTA，包含使用前加入的 1% Triton X-100)l 小時(shí)。溶胞后，用蒸餾水洗滌載玻片，將其縱向排列在電泳槽中，沉入堿性緩沖液（50mM NaOH，pH 12-12. 5, ImM EDTA)30 分鐘。然后在 18V(0. 6V/cm)、250mA 的條件下，使載玻片在 堿性（pH> 13,300mM NaOH，lmM EDTA)和中性溶液（1 X TBE)中電泳25分鐘。堿性電泳 探測(cè)的是從AP位點(diǎn)和其他對(duì)堿性不穩(wěn)定的DNA加合物產(chǎn)生的單鏈和雙鏈DNA斷裂，而中性 電泳主要探測(cè)的是雙鏈DNA斷裂。取出載玻片，用中和緩沖液（0. 5M Tris-HCl，pH 7. 5)洗 滌10分鐘，然后用PBS洗滌，之后將其在室溫下過夜風(fēng)干。根據(jù)制造者的說明書利用銀染 色試劑盒（Trevigen)將DNA染色。使用Olympus顯微鏡觀察彗星。用數(shù)碼相機(jī)捕獲圖象 并利用NIH圖象軟件分析。
[0197] 彗星圖象顯示在圖1A(堿性測(cè)定法）和1B(中性測(cè)定法）中。用培美曲塞和MX 處理之后，觀察不同的彗星，其