拖尾長(zhǎng)度是用單獨(dú)MX處理長(zhǎng)度的大約4倍，是用單獨(dú)培美曲 塞處理長(zhǎng)度的大約2倍（圖1C-D)。
[0198] 來(lái)自異種嫁接有效性研宄、AP位點(diǎn)測(cè)定法和彗星測(cè)定法的結(jié)果顯示，MX充當(dāng)了 AP 位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)性調(diào)節(jié)劑，通過(guò)逆轉(zhuǎn)對(duì)化療的耐藥性，增強(qiáng)了抗代謝藥培美曲塞的治療效果，從 而產(chǎn)生協(xié)同作用。
[0199]實(shí)施例4
[0200] 分析AP位點(diǎn)或MX-AP位點(diǎn)對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶II-介導(dǎo)的DNA切割的影響。位置-特 異性無(wú)嘌呤位點(diǎn)通過(guò)下列步驟而引入：用脫氧尿苷在拓?fù)洚悩?gòu)酶II切割部位替換單核苷， 然后用尿嘧啶-DNA糖基化酶除去尿嘧啶堿基，產(chǎn)生AP位點(diǎn)，進(jìn)一步用MX培養(yǎng)該AP位點(diǎn)以 制備MX-AP位點(diǎn)（圖5A)。
[0201] 首先，確定APE是否在規(guī)則AP位點(diǎn)和MX-AP位點(diǎn)間具有不同的效果，AP位點(diǎn)和 MX-AP位點(diǎn)位于對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶II切割來(lái)說(shuō)位置特異的位點(diǎn)。結(jié)果顯示APE能切割規(guī)則AP 位點(diǎn)而不能切割MX-結(jié)合的AP位點(diǎn)（圖5B)，然而，AP和MX-AP位點(diǎn)都可以被拓?fù)洚悩?gòu)酶 II切割，表明MX-AP位點(diǎn)能刺激拓?fù)洚悩?gòu)酶II-介導(dǎo)的DNA切割。
[0202] 實(shí)施例5
[0203]通過(guò)向 Sprague Dawley 大鼠（Non-GLP)快速灌注（single bolus)給藥來(lái)研宄 MX 的口服和靜脈生物利用度。進(jìn)行下面描述的研宄，通過(guò)比較MX快速灌注口服和靜脈施用后 的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，來(lái)評(píng)估安全劑量水平下甲氧胺（MX)的生物利用度。
[0204]試駘動(dòng)物在研宄過(guò)程中使用30只雄性和30只雌性體重為250_350g的7-10周 齡 Sprague Dawley 大鼠。
[0205]給藥制劑和濃度在給藥的當(dāng)天配制單劑量溶液，調(diào)整檢品為98%純度，為了獲得 4.0011^/1^濃度的"活性"1?，在200-1^的容量瓶中將816.7711^的1?溶入5%葡萄糖中。 將所制備的溶液平均分到兩個(gè)琥珀色瓶中用于口服給藥或靜脈給藥。在制備時(shí)和給藥后取 整分試樣用于分析，用干冰運(yùn)輸，在<-70°C的溫度下貯藏。
[0206]劑量給藥在給藥那天對(duì)所有的動(dòng)物稱重。各個(gè)動(dòng)物的劑量以該體重為基礎(chǔ)。使 用5mL/kg的恒定劑量體積。使用連接到26Gxl"針頭的3-mL注射器，將靜脈劑量通過(guò)快 速灌注注射到尾靜脈中。靜脈劑量以大約2mL/min的速度給藥。用連接到3-mL注射器的 18Gx2 "輸送針頭以快速灌注的方式施用口服劑量。
[0207]血樣采集在給藥后5、15、30分鐘和1、2、4、6、8、12和24小時(shí)采集血樣，每只動(dòng)物 在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集血樣。在較早時(shí)間點(diǎn)通過(guò)頸靜脈采集血樣，在較后的時(shí)間點(diǎn)在處死動(dòng)物 時(shí)通過(guò)腹靜脈采集血樣。血液從抽取注射器（drawing syringe)轉(zhuǎn)移到包含K3-EDTA作為 抗凝血?jiǎng)┑?mL血液采集試管中，并倒轉(zhuǎn)以使其混合。在用C0 2安樂(lè)死之后迅速進(jìn)行腹靜 脈血米集。
[0208]血漿樣品制各和貯藏備件在離心制備血漿之前將血液試管放置在濕冰（wet ice)上。在4°C下以3000rpm的速度將全血樣品離心分離10分鐘。將血漿吸取到試管中， 開(kāi)始放置在干冰上，隨后在< -70°C的溫度下貯藏。
[0209]質(zhì)譜（,MS)根據(jù)如下列出的說(shuō)明，通過(guò)有陽(yáng)性渦輪噴霧（positive turbo spray) 的電噴離子化作用進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。
[0210] MS 儀器：Applied Biosystems 3000
[0211] HPLC 儀器：Agilent llOOSeries Binary Pump
[0212] 自動(dòng)采樣器：LEAP Technologies CTC-PAL
[0213] 電噴離子化（ESI)條件：
[0214]
[0215] 監(jiān)視器：
[0216]分析物：207. 0/149. 3 和 207. 0/178. 4 原子量
[0217] IS (硝芐香豆素（Acenocoumerol)) :354. 2/296. 0 和 354. 2/163. 1 原子量 HPLC 條 件（在Agilent 1100上進(jìn)行）：
[0218] 流動(dòng)相A :0. 1%甲酸水溶液
[0219] 流動(dòng)相B :0. 1%甲酸的乙腈溶液
[0220] 柱：Thermo Aquas il C18, 50x3mm
[0221] 保護(hù)柱：Thermo Aquas il C18,10x4mm
[0222] 流速：1. OmL/min
[0223]注射量：50 UL
[0224]梯度：
[0225]
[0226]血漿樣品LC-MS/MS分機(jī)仕邱境M皮卜符合個(gè)皿澩桿bI解凍，如果不需要稀釋則 取250 y L整分試樣進(jìn)行分析。在5分鐘至1小時(shí)從靜脈給藥動(dòng)物所取的樣品和在15分鐘 至8小時(shí)從口服給藥動(dòng)物所取的樣品需要稀釋5至40倍以落入該方法的線性范圍內(nèi)（1至 1，000ng/mL)。對(duì)于需要稀釋的樣品，取適當(dāng)?shù)牧坎⑴c含相同抗凝血?jiǎng)┑目瞻状笫笱獫{混合 以達(dá)到250 yL的總量。用稀釋因子對(duì)定量結(jié)果進(jìn)行校正。如下制備用于LC-MS/MS分析的 血漿：
[0227] ?將各部分血漿渦旋30秒，以14, OOOrpm的速度離心10分鐘以使干擾顆粒沉淀。
[0228] ?從上清液取100 yL整分試樣，置于1.5mL的微量離心管中。
[0229] ?向該lOOyL血漿整分試樣加入310yL的水：甲酸（2 : l)、30yL硝芐香豆素 (IS)的水溶液（10 y g/mL)和100 y L二乙基氨基苯甲醛的2 : 1水：甲酸溶液（10mg/mL)， 并均勻混合。
[0230] ?然后將混合物在80°C的水浴中培養(yǎng)2小時(shí)。培養(yǎng)過(guò)后，將上清液轉(zhuǎn)移到HPLC瓶 中進(jìn)行LC-MS/MS定量。
[0231] 甲氣胺（MX)藥代動(dòng)力學(xué)和牛物利用度分析
[0232]藥代動(dòng)力學(xué)分析以20mg/kg體重的劑量經(jīng)靜脈和口服將MX快速灌注給藥后，在 雄性和雌性Sprague Dawley大鼠中測(cè)定甲氧胺（MX)藥代動(dòng)力學(xué)（PK)曲線和口服生物利 用度。每個(gè)給藥途徑有30只大鼠（15只雄性和15只雌性）用于藥代動(dòng)力學(xué)分析。為了獲 得MX藥代動(dòng)力學(xué)特征，在預(yù)劑量標(biāo)稱取樣（nominal sampling)時(shí)間之時(shí)，以及給藥5、15、 30分鐘和1、2、4、6、8、12和24小時(shí)后獲取血漿樣品。為了維持正常的健康狀況，在預(yù)定時(shí) 間點(diǎn)對(duì)每只大鼠最多抽血兩次以產(chǎn)生血漿。代表性的MX濃度是通過(guò)將來(lái)自每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上 相同性別和給藥途徑的三只大鼠的值進(jìn)行平均而獲得的。對(duì)于平均劑量，平均實(shí)際取樣時(shí) 間相應(yīng)地來(lái)自每個(gè)標(biāo)稱時(shí)間點(diǎn)上相同性別和給藥途徑的三只大鼠。平均血漿MX濃度、平均 劑量、和平均實(shí)際取樣時(shí)間用于每個(gè)給藥途徑的藥代動(dòng)力學(xué)分析。
[0233] 利用Microsoft Excel2000-SR1?創(chuàng)建各個(gè)性別和給藥途徑的平均血漿MX濃度 對(duì)平均取樣時(shí)間曲線（圖2-3)。為了藥代動(dòng)力學(xué)建模的目的，所記載的低于可定量范圍 (BQL)或者檢測(cè)不到的血漿MX濃度，即便有也認(rèn)為是0.0 Ong/mL。
[0234]通過(guò)WinNonlin 5. 1 (Pharsight Corporation，Mountain View，CA)使用無(wú)房室模 型進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)分析。藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)包括最大血漿濃度（C_)、最大血漿濃度的時(shí) 間（T_)、清除半衰期（t 1/2)、從時(shí)間零點(diǎn)至最后可測(cè)量血漿濃度的血漿濃度對(duì)時(shí)間曲線下 的面積（AUClast)，和從時(shí)間零點(diǎn)延伸至無(wú)窮的血漿濃度對(duì)時(shí)間曲線下的面積（AUQ^)。為 了比較，AUC^被標(biāo)準(zhǔn)化至5mg標(biāo)稱總MX劑量（AUC^ 5)。藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)以先前陳述的 方式縮寫(xiě)。
[0235]牛物利用度分析以Microsoft Excel 2000-SR1?利用下述方程式，由口服與靜脈 甲氧胺（MX)AUQ^的比值（標(biāo)準(zhǔn)化至總劑量5mg的MX)來(lái)確定絕對(duì)口服生物利用度（MX = TRC102)：
[0236]
[0237] 在靜脈給藥組中雄性和雌性大鼠的實(shí)際MX劑量水平分別是20. lmg/kg和20. lmg/ kg，在口服給藥組中雄性和雌性大鼠的實(shí)際MX劑量水平分別是19. 9mg/kg和20. 0mg/kg。
[0238]藥代動(dòng)力學(xué)和牛物利用度表1中列出了以20mg/kg體重的劑量經(jīng)靜脈和口服快 速灌注給藥后雄性和雌性Sprague Dawley大鼠的甲氧胺（MX)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。
[0239] 表1以20mg/kg體重的劑量經(jīng)靜脈和口服快速灌注給藥MX后雄性和雌性Sprague Dawley大鼠的血漿MX藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。
[0240]
[0241] 5 (ng/mL*hr)是通過(guò)將AUC^ (ng/mL*hr)標(biāo)準(zhǔn)化至總劑量5mg MX得到的。
[0242] 對(duì)于靜脈和口服給藥的雄性大鼠來(lái)說(shuō)，在整個(gè)24小時(shí)的取樣時(shí)期內(nèi)血漿中都具 有可定量的MX濃度。目檢雄性靜脈平均血漿MX濃度與平均時(shí)間曲線顯示了快速的分布 相，這在給藥后大約2小時(shí)完成。靜脈途徑C max為15, 510ng/mL，并在推注給藥完成時(shí)立即 產(chǎn)生。如AUClas# AUC _所表明的，全身性MX接觸分別為12, 518ng/mL*hr和12, 706ng/ mL*hr。被調(diào)整為標(biāo)稱總劑量5mg的靜脈AUC^ (AUC^ 5)為11，284ng/mL*hr。
[0243] 對(duì)于口服給藥途徑的雄性大鼠來(lái)說(shuō)，MX吸收迅速，Tmax為1. 0小時(shí)。2, 205ng/mL 的Cmax被認(rèn)為比靜脈給藥途徑低。如口服AUC last和AUQ^所表明的，全身性MX接觸分別 為 13, 596ng/mL*hr 和 13, 811ng/mL*hr。被調(diào)整為標(biāo)稱總劑量 5mg 的口服 AUCQ_ (AUCQ_ 5) 為12,420ng/mL*hr。清除半衰期很短，類似介于兩種給藥途徑之間（靜脈：5.2hr，口服： 4. 2hr)。雄性Sprague Dawley大鼠經(jīng)口服給藥所計(jì)算出的絕對(duì)生物利用度是110%。
[0244] 對(duì)于靜脈和口服給藥的雌性大鼠來(lái)說(shuō)，在整個(gè)24小時(shí)的取樣時(shí)期內(nèi)都具有可定 量的MX血漿濃度。與雄性大鼠相似，目檢雌性靜脈平均血漿MX濃度與平均時(shí)間曲線顯示 了快速的分布相，這出現(xiàn)在給藥后大約2小時(shí)。靜脈途徑C max為10, 965ng/mL，在推注給藥 完成時(shí)立即出現(xiàn)。如AUClas# AUC所表明的，全身性MX接觸分別為12, 971ng/mL*hr和 13, 142ng/mL*hr。被調(diào)整為標(biāo)稱總劑量 5mg 的靜脈 AUQ^ (AUQ^ 5)為 13, 892ng/mL*hr。
[0245] 對(duì)于口服給藥途徑的雌性大鼠來(lái)說(shuō)，MX吸收迅速，Tmax為0. 5小時(shí)。2959ng/mL的 C_顯著低于靜脈途徑，這也與口服給藥途徑的雄性大鼠相似。如口服AUC last和AUC^所 表明的，全身性MX接觸分別為11，643ng/mL*hr和12, 029ng/mL*hr。被調(diào)整為標(biāo)稱總劑量 5mg的口服AUQ^ (AUQ^S)為13,047ng/mL*hr。清除半衰期很短，類似介于兩種給藥途 徑之間（靜脈：4. 6hr，口服：5. 7hr)，且與雄性大鼠相當(dāng)。雌性Sprague Dawley大鼠所計(jì)算 出的絕對(duì)生物利用度是94%。
[0246] 以20mg/kg體重（BW)劑量靜脈或口服給藥的大鼠沒(méi)有顯示臨床毒性跡象。
[0247] 在雄性和雌性Sprague Dawley大鼠中，以20mg/kg BW劑量經(jīng)快速灌注口服給藥 施用的MX被迅速（Tmax 0.5-1. Ohr)和完全地吸收，全身絕對(duì)生物利用度為大約100%。盡 管口服MX C_明顯低于靜脈C _，但是如AUClas# AUC _所示，兩種給藥途徑之間全身MX 接觸是相似的。而且，口服給藥后在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)血清水平超過(guò)了與在人癌癥小鼠模型中活 性相關(guān)的目標(biāo)(：_值（50ng/mL)，這將允許使用每天一次或每天兩次的給藥方案。
[0248] 這些數(shù)據(jù)在下述方面是顯著的，即它們表明甲氧胺完全口服生物有效并具有4-6 小時(shí)的半衰期，這允許每天一次或每天兩次給藥而獲得最低有效濃度。這些發(fā)現(xiàn)是意外的。 足量的多數(shù)抗癌藥口服都是不可生物利用的從而不允許口服給藥。應(yīng)當(dāng)注意的是口服施用 其他特別抗癌藥的嘗試獲得了比本文低得多的生物利用度。參見(jiàn)例如博來(lái)霉素、卡鉑、順 鉑、奧沙利鉑、紫杉醇、雷替曲塞（一種抗葉酸劑）、托泊替康、長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春瑞濱， 所有這些抗癌藥具有低于50%的生物利用度（Chu E and DeVita VT. Physicians' Cancer Chemotherapy Drug manual 2002. Boston : Jones and Bartlett Publishers，2002)，第二， 證明的半衰期比分子量< 100道爾頓的小分子的預(yù)期半衰期長(zhǎng)，這些小分子容易與可存在 于血漿中的醛發(fā)生反應(yīng)，并且比預(yù)期更長(zhǎng)的血漿半衰期允許每天一次或每天兩次口服給藥 方案具有持續(xù)的藥物水平（高于最低有效濃度）。完全的生物利用度和4至6小時(shí)的半衰 期可以允許對(duì)癌癥患者方便的每天一次或每天兩次給藥方法口服給藥。
[0249] 通過(guò)上述描述，上述方法和組合物的各種變形可以在不脫離本發(fā)明精神和范圍的 情況下作出，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)將是顯而易見(jiàn)的。相應(yīng)地，在不脫離其精神或必要特 征的前提下本發(fā)明可以其他特定形式具體實(shí)施。因此，目前的實(shí)施方式和實(shí)施例在所有方 面當(dāng)以示例性而非限制性地被考慮，因此在權(quán)利要求等同的意義和范圍內(nèi)的所有改變都意 欲包含在本文之內(nèi)。
[0250] 因此，將理解的是，沒(méi)有以這些術(shù)語(yǔ)和表達(dá)的使用來(lái)排除所顯示和描述特征的任 何等同形式或者它們的一部分的意圖，但是，可以認(rèn)識(shí)到的是，在所請(qǐng)求的本發(fā)明的范圍內(nèi) 進(jìn)行各種修飾是可能的。也將理解的是各種落入一般公開(kāi)范圍內(nèi)的較窄的種類和一般之下 的（subgeneric)組也組成了本發(fā)明的部分。這包括附有從一般性中排除任何主題的條件 或否定性限制從一般性中排除任何主題的本發(fā)明的一般性敘述，不管被排除的內(nèi)容是否在 本文中被特別敘述。
[0251]本文援引或提及的所有專利、出版物、科技文章、網(wǎng)站和其他文獻(xiàn)和材料顯示了本 發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)水平，因此每個(gè)援引的文獻(xiàn)和材料以與其各自全部?jī)?nèi)容已經(jīng) 通過(guò)援引的方式引入或者其全部?jī)?nèi)容已在本文闡述的相同程度通過(guò)援引由此引入。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 含培美曲塞的劑型和含甲氧胺的劑型在制備用于治療選自非小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸直腸 癌和乳癌的癌癥的藥物中的應(yīng)用，其中甲氧胺與培美曲塞的比例是1:15至1:100。2. 權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中甲氧胺和培美曲塞作為一種制劑施用。3. 權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中甲氧胺和培美曲塞以任何順序連續(xù)施用。4. 權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中甲氧胺口服施用，培美曲塞口服或靜脈施用。5. 權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中甲氧胺與培美曲塞的比例足以使癌癥細(xì)胞對(duì)培美曲塞敏 感。6. 權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中施用甲氧胺和培美曲塞以獲得協(xié)同作用。7. 權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中培美曲塞口服或靜脈施用，甲氧胺每天一次或兩次口服施 用，其中甲氧胺與培美曲塞的比例足以增強(qiáng)培美曲塞的活性。8. 權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中培美曲塞口服或靜脈施用，甲氧胺每天一次或兩次口服施 用，其中甲氧胺與培美曲塞的比例足以使癌癥細(xì)胞對(duì)培美曲塞敏感。9. 抗癌組合物，其包含：含培美曲塞的劑型和含甲氧胺的劑型，其中甲氧胺與培美曲 塞的比例是1:15至1:40。10. 權(quán)利要求9的組合物，其中所述組合物用于治療診斷患有選自非小細(xì)胞肺 癌、結(jié)腸直腸癌和乳癌的癌癥的患者。11. 權(quán)利要求9的組合物，其中甲氧胺和培美曲塞作為一種制劑施用。12. 權(quán)利要求9的組合物，其中甲氧胺和培美曲塞以任何順序連續(xù)施用。13. 權(quán)利要求9的組合物，其中甲氧胺口服施用，培美曲塞口服或靜脈施用。14. 權(quán)利要求9的組合物，其中甲氧胺與培美曲塞的比例足以使癌癥細(xì)胞對(duì)培美曲塞 敏感。15. 權(quán)利要求9的組合物，其中施用甲氧胺和培美曲塞以獲得協(xié)同作用。16. 權(quán)利要求9的組合物，其中培美曲塞口服或靜脈施用，甲氧胺每天一次或兩次口服 施用，其中甲氧胺與培美曲塞的比例足以增強(qiáng)培美曲塞的活性。17. 權(quán)利要求9的組合物，其中培美曲塞口服或靜脈施用，甲氧胺每天一次或兩次口服 施用，其中甲氧胺與培美曲塞的比例足以使癌癥細(xì)胞對(duì)培美曲塞敏感。
【專利摘要】本發(fā)明涉及抗葉酸藥在癌癥治療中的聯(lián)合應(yīng)用。還涉及在治療某些癌癥中有用的組合物和方法。該方法包括向接受抗葉酸抗癌藥的患者施用甲氧胺，所述甲氧胺以足以增強(qiáng)或增加抗葉酸抗癌藥效果的量施用。本申請(qǐng)的一部分是基于這樣的認(rèn)識(shí)作出的，即某些靶向DNA中脫堿基損傷或AP位點(diǎn)的分子改善、增加或增強(qiáng)了某些抗癌藥的化學(xué)治療效力。
【IPC分類】A61P35/00, A61K31/137, A61K31/519
【公開(kāi)號(hào)】CN104958299
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510148536
【發(fā)明人】C.P.托伊爾, B.J.亞當(dāng)斯
【申請(qǐng)人】特雷康制藥公司
【公開(kāi)日】2015年10月7日
【申請(qǐng)日】2007年12月21日
【公告號(hào)】CA2674075A1, CA2674075C, CN102014887A, EP2173333A2, US8017618, US20080234298, WO2008083107A2, WO2008083107A3