腫瘤干細胞分子標記的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子標記，其為用于檢測作為檢測對象的細胞團中的腫瘤干細胞的分 子標記，其在該檢測對象所含的腫瘤干細胞中能檢測到，但在非腫瘤干細胞的癌細胞和正 常細胞中檢測不到。
【背景技術】
[0002] 腫瘤干細胞被認為是癌癥復發(fā)、轉移的主要原因，癌癥治療中以腫瘤干細胞為靶 標的重要性已被指出。但是腫瘤組織中腫瘤干細胞比率較低（非專利文獻4)，特異性識別 腫瘤干細胞并進行治療是極其困難的。腫瘤干細胞的檢測技術以及以腫瘤干細胞為靶標的 新療法的開發(fā)已成為癌癥醫(yī)療中的重要課題。
[0003]目前，作為已知的腫瘤干細胞標記，有⑶133、⑶24、⑶44等分子標記（非專利文獻 1~7)，據說僅在極少數(shù)癌細胞中具有有效性，為了在更多種類的癌癥中檢測腫瘤干細胞， 需要鑒定新的分子標記。
[0004] 現(xiàn)有技術文獻
[0005]非專利文獻 I :Shu Zhang et al.，Cancer Res. 68:(11)4311-4320, 2008
[0006]非專利文獻 2：Sh i h-Hwa Chiou et al. , Clin. Cancer Res. 14(13)4085-4095, 2008
[0007]非專利文獻 3 :Gang-Ming Zou, J. Cell. Physiol. 217 :598-604, 2008
[0008]非專利文獻 4 :Cheong J. Lee et al., J Clin Oncol 26 :2806-2812,2008
[0009]非專利文獻 5 :Madhuri Kakarala et al. , J Clin Oncol 26 :2813-2820, 2008
[0010]非專利文獻 6 :Craig D. Peacock et al., J Clin Oncol 26 :2883-2889,2008
[0011]非專利文獻 7 :Xing Fan et al. , J Clin Oncol 26 :2821-2827, 2008

【發(fā)明內容】

[0012] 發(fā)明要解決的問題
[0013] 本發(fā)明的目的在于，提供在腫瘤干細胞的檢測中有用的分子標記。
[0014] 解決問題的手段
[0015] 為解決上述課題，本發(fā)明人等在持續(xù)進行深入研究時著眼于如下新的見解，所述 新見解為：對于腫瘤干細胞標記基因而言必不可少的是，在至少1種組織中有用性更高且 優(yōu)選在多個組織中的來源于該組織的正常細胞中看不到表達、在腫瘤干細胞中能看到表 達，即在鑒定腫瘤干細胞基因時的待測物中通常含有正常組織的情況下在該待測物中的正 常組織中幾乎不表達。并且判明：迄今為止所報告的針對腫瘤干細胞的標記基因在正常組 織中幾乎都高水平表達，而本發(fā)明人等在進一步研究中發(fā)現(xiàn)，已知的轉錄因子基因-性別 決定Y區(qū)域轉錄因子2(Sex determinig Region Y-box2，Sox2)基因雖然在成人正常細胞中 看不到表達，但意外的是其在腫瘤干細胞中表達。并且，進一步研究時發(fā)現(xiàn)，以精子線粒體 相關富含半胱酸蛋白（Sperm Mitochondria-associated Cysteine-rich Protein, Smcp) 基因為首的其它基因也是在成人正常細胞中幾乎不表達而在腫瘤干細胞中表達，從而完成 了本發(fā)明。
[0016] 即，本發(fā)明涉及分子標記，其為用于檢測作為檢測對象的細胞團中的腫瘤干細胞 的分子標記，其在該檢測對象所含的腫瘤干細胞中能檢測到，但在非腫瘤干細胞的癌細胞 和正常細胞中檢測不到。
[0017]此外，本發(fā)明涉及前述分子標記，檢測對象為來源于選自心臟、腦、胎盤、肺、肝臟、 骨骼肌、腎臟、胰臟、脾臟、胸腺、前列腺、精巢、卵巢、小腸、白細胞、結腸、胃、骨髓、大腸和末 梢血單核細胞所組成的組中的1種或2種以上細胞或組織的細胞團。
[0018]進而，本發(fā)明涉及前述分子標記，其在本發(fā)明全部檢測對象的非腫瘤干細胞的癌 細胞和正常細胞中檢測不到。
[0019]進而，本發(fā)明還涉及前述分子標記，該分子標記為選自0r7cl、Dnajb8、Sox2、Smcp、 Intsl、Koxl2、Mdn、FU13464、667J232、Surf6、Pcdhl9、Dchs2、Pcdh21、Gal3stl、Raslllb、 Hes6、Znf415、Nkx2 - 5、Pamci、Pnmt和Scgb3al所組成的組中的1種或2種以上基因的表 達產物。
[0020] 此外，本發(fā)明涉及以前述分子標記為指標來判定判定對象中是否存在腫瘤干細胞 的方法。
[0021] 進而，本發(fā)明涉及前述方法，細胞團含有正常細胞和/或非腫瘤干細胞的癌細胞。
[0022] 進而，本發(fā)明涉及前述方法，細胞團來源于選自心臟、腦、胎盤、肺、肝臟、骨骼肌、 腎臟、胰臟、脾臟、胸腺、前列腺、精巢、卵巢、小腸、白細胞、結腸、胃、骨髓、大腸和末梢血單 核細胞所組成的組中的1種或2種以上細胞或組織。
[0023] 此外，本發(fā)明涉及前述方法，判定是指：在檢測到選自0r7cl、Dnajb8、Sox2、Smcp、 Intsl、Koxl2、Mdn、FU13464、667J232、Surf6、Pcdhl9、Dchs2、Pcdh21、Gal3stl、Raslllb、 Hes6、Znf415、Nkx2 - 5、Pamci、Pnmt和Scgb3al所組成的組中的I種或2種以上基因的表 達產物的情況下，判定為存在腫瘤干細胞。
[0024] 此外，本發(fā)明涉及前述方法，基因的表達產物為mRNA和/或內源性多肽。
[0025] 此外，本發(fā)明涉及前述方法，基因的表達產物為mRNA，該方法包括利用RT - PCR法 檢測的步驟。
[0026]此外，本發(fā)明涉及前述方法，基因的表達產物為內源性多肽，該方法包括利用與該 內源性多肽特異性反應的試劑檢測的步驟。
[0027]此外，本發(fā)明涉及前述方法，試劑為抗體。
[0028] 此外，本發(fā)明涉及前述方法，判定在體外或體內進行。
[0029]此外，本發(fā)明涉及癌癥治療藥的篩選方法，其包括下述步驟：
[0030] i)測定前述分子標記的、對細胞團投與候補化合物前的檢測量A的步驟，
[0031] ii)對細胞團投與候補化合物的步驟，
[0032] iii)測定i)中所測定的分子標記的、對細胞團投與候補化合物后的檢測量B的步 驟，和
[0033] iv)比較A和B，在A顯著大于B的情況下，將候補化合物判定為候補癌癥治療藥 的步驟。
[0034] 進而，本發(fā)明涉及用于判定腫瘤干細胞是否存在的試劑盒，其含有用于檢測前述 分子標記的試劑。
[0035] 此外，本發(fā)明涉及前述試劑盒，用于檢測的試劑為用于檢測mRNA的、具有與下述 基因互補的堿基序列的探針和/或引物，所述mRNA為選自0r7cl、Dnajb8、Sox2、Smcp、 Intsl、Koxl2、Mdn、FU13464、667J232、Surf6、Pcdhl9、Dchs2、Pcdh21、Gal3stl、Raslllb、 Hes6、Znf415、Nkx2 - 5、Pamci、Pnmt和Scgb3al所組成的組中的I種或2種以上基因的表 達產物。
[0036] 此外，本發(fā)明涉及用于判定腫瘤干細胞是否存在的試劑盒，用于檢測的試劑為 用于檢測多肽的抗體，所述多肽為選自0r7cl、Dnajb8、Sox2、Smcp、Intsl、Koxl2、Mdfl、 FU13464、667J232、Surf6、Pcdhl9、Dchs2、Pcdh21、Gal3stl、Raslllb、Hes6、Znf415、Nkx2 - 5、Pamci、Pnmt和Scgb3al所組成的組中的I種或2種以上基因的表達產物。
[0037] 本發(fā)明還涉及癌癥的判定方法，其使用前述試劑盒。
[0038] 本發(fā)明還涉及多肽，所述多肽為能夠用作用于抑制腫瘤干細胞的功能或殺滅腫 瘤干細胞的抗原的多肽，所述多肽為由0r7cl、Dnajb8、Sox2、Smcp、Intsl、Koxl2、Mdfl、 FU13464、667J232、Surf6、Pcdhl9、Dchs2、Pcdh21、Gal3stl、Raslllb、Hes6、Znf415、Nkx2 - 5、Pamci、Pnmt和Scgb3al所編碼的多肽或其一部分，或者在該多肽或其一部分中缺失、置 換或添加1個或多個氨基酸而形成的多肽。
[0039] 本發(fā)明還涉及抗體，該抗體與源于選自0r7cl、Dnajb8、Sox2、Smcp、Intsl、Koxl2、 Mdfl、FU13464、667J232、Surf6、Pcdhl9、Dchs2、Pcdh21、Gal3stl、Raslllb、Hes6、Znf415、 Nkx2 - 5、Pamci、Pnmt和Scgb3al所組成的組中的1種或2種以上基因的表達產物的表位 特異性反應。
[0040] 此外，本發(fā)明涉及藥物組合物，其含有至少一種以上的前述多肽和/或前述抗體。
[0041] 本發(fā)明還涉及前述藥物組合物，藥物組合物為癌癥治療用或癌癥預防用組合物。
[0042] 本發(fā)明還涉及將前述多肽作為抗原抑制腫瘤干細胞的功能、或殺滅腫瘤干細胞的 方法。
[0043] 此外，本發(fā)明涉及前述方法，所述方法使用前述抗體。
[0044] 本發(fā)明還涉及編碼前述多肽的核酸。
[0045] 本發(fā)明還涉及含有前述核酸的藥物組合物。
[0046] 此外，本發(fā)明涉及前述藥物組合物，所述藥物組合物為DNA或RNA疫苗用藥物組合 物。
[0047] 本發(fā)明還涉及通過主要組織適合抗原進行抗原呈遞的肽的篩選方法，所述方法包 括下述步驟：
[0048]i)制備將目標多肽切斷而成的具有適當長度的肽片段的步驟，
[0049]ii)將i)中獲得的肽片段、抗原呈遞細胞、和用目標多肽和/或i)中獲得的肽片 段致敏的T細胞一起培養(yǎng)的步驟，
[0050] iii)測定ii)中獲得的T細胞的活化程度的步驟，
[0051] iv)篩選iii)中使T細胞活化的肽片段的步驟，
[0052] 其中，目標多肽為前述多肽。
[0053] 本發(fā)明還涉及核酸，該核酸用于抑制腫瘤干細胞中選自0r7cl、Dnajb8、Sox2、 Smcp、Intsl、Koxl2、Mdfl、FLJ13464、667J232、Surf6、Pcdhl9、Dchs2、Pcdh21、Gal3stl、 Raslllb、Hes6、Znf415、Nkx2 - 5、Pamci、Pnmt 和 Scgb3al 所組成的組中的基因的表達。
[0054] 此外，本發(fā)明涉及前述核酸，該核酸為DNA和/或RNA。
[0055] 此外，本發(fā)明涉及藥物組合物，其含有至少1種以上前述核酸。
[0056] 此外，本發(fā)明涉及藥物組合物，該藥物組合物為癌癥治療用組合物。
[0057] 此外，本發(fā)明涉及使用前述核酸抑制腫瘤干細胞的功能的方法。
[0058] 發(fā)明效果
[0059] 本發(fā)明提供的分子標記能夠判別癌細胞所含的腫瘤干細胞、和非腫瘤干細胞的癌 細胞。并且前述判別能夠通過檢測單一分子標記來進行，因此能夠極其簡便地判別腫瘤干 細胞。
[0060] 此外，本發(fā)明的分子標記能夠在肺癌細胞、乳腺癌細胞、大腸癌細胞等、多種腫瘤 干細胞中通用，作為具有通用性的腫瘤干細胞的分子標記是極其有效的。
[0061] 進而，本發(fā)明的分子標記在正常細胞中完全檢測不到或者幾乎檢測不到，因此在 腫瘤干細胞的判別、以及含有腫瘤干細胞的腫瘤組織的判別中也是有用的。
[0062] 此外，本發(fā)明的分子標記與成瘤性的相關性高，在以它們?yōu)榘袠说哪[瘤干細胞的 免疫療法、分子靶標治療法、基因導入治療法以及能夠用于癌癥治療的藥劑、肽等的篩選中 也是有用的。
【附圖說明】
[0063]圖1是表示肺癌細胞系中SP解析結果的圖。用線包圍的部分為各自的SP級分，％ 表示SP級分細胞相對于全部細胞的比例。
[0064] 圖2是表示在N0D/SCID小鼠中腫瘤形成能力實驗的結果的圖。a)為移植后第8 周的小鼠的照片。b)為移植了 LHK2(肺癌細胞）的全部小鼠的腫瘤直徑平均值土標準偏 差、腫瘤存活的小鼠數(shù)/移植的全部小鼠數(shù)的表。c)為將分別移植了 1500個LHK2(肺癌細 胞）、MCF7 (乳腺癌細胞）、SW480 (大腸癌細胞）的組每周腫瘤大小的平均值圖表化的圖。 [0065]圖3:圖3的a)為表示人成人正常細胞中Sox2的表達的圖，b)為表示癌細胞細胞 系的SP級分和MP級分中Sox2的表達的圖。
[0066] 圖4:圖4的a)為表示人成人正常細胞中Smcp和FLJ13464的表達的圖，b)為表 示癌細胞細胞系的SP級分和MP級分中Smcp和FLJ13464的表達的圖。
[0067] 圖5為表不調查的基因在各細胞中的表達的一覽表的圖。圖中，看不到表達者表 示為陰性，能看到表達者表示為陽性、能看到極微量表達但尚不能稱之為顯著表達的微量 表達表示為假陽性。另外，假陽性判定為"檢測不到"。此外，圖中LHK2為肺癌、MFH03為 軟組織肉瘤、MCF7為乳腺癌、LHK2 - S0X2為過度表達S0X2基因的LHK2細胞系、SW480和 KM12為大腸癌細胞系。
[0068] 圖6是表示其它癌細胞系中Sox2的表達的圖。
[0069] 圖7是表不其它癌細胞系中Smcp的表達的圖。表不的是將PCR循環(huán)分別設定為 35個循環(huán)和40個循環(huán)進行調查的結果。圖中Caki - 1、ACHN、SMKTR - 1~4為腎細胞癌 的細胞系，Sq - 1為肺癌扁平上皮癌的細胞系，1 一 87、A549、LHK2為肺癌腺癌的細胞系， LC817為肺癌小細胞癌癥的細胞系，86 - 2、Lu99為肺癌大細胞癌癥的細胞系，HPC3為胰臟 癌癥的細胞系，LCC(Mouse)為小鼠肺癌細胞。
[0070]圖8:圖8a)為表示正常細胞和癌細胞系SW480、KM12、LHK2、MCF7的SP級分和MP 級分中Intsl的表達的圖；b)為表示癌細胞系中Intsl的表達的圖。圖中癌細胞系與圖6 和圖7中相同。
[0071] 圖9是表示肺癌組織中免疫組織染色的結果的圖。情形1和情形2分別為來自不 同癌癥患者的肺扁平上皮癌組織的染色像。藍色部分表示通過蘇木精染色而被染色的核， 茶色部分為通過抗S0X2抗體染色后的S0X2抗原蛋白。
[0072] 圖10是表示乳腺癌組織中免疫組織染色的結果的圖。情形1為細胞質圖案，情形 2為核圖案的染色像，CK5為用抗CK5抗體染色的染色像，S0X2為用抗S0X2抗體染色的染 色像。藍色部分表示通過蘇木精染色而被染色的核，茶色部分為通過抗CK5抗體或抗S0X2 抗