體染色后的抗原蛋白。
[0073] 圖11中a)是表示腦、b)是表示肺、c)是表示胰臟、d)是表示胃中免疫組織染色 的結果的圖。藍色部分表示通過蘇木精染色而被染色的核，茶色部分為通過抗S0X2抗體染 色后的S0X2抗原蛋白。黑箭頭所示的部分表示被S0X2抗體稍微染色的細胞。
[0074] 圖12是觀察S0X2的強制表達所致的成瘤能力變化的圖表。左邊的照片為腫瘤移 植9周后小鼠的照片。右邊的圖表是將移植了 10000個細胞的組的經(jīng)過9周后的腫瘤大小 的平均值圖表化的結果。圖表中，黑正方形表示強制表達S0X2的LHK2細胞，黑菱形表示作 為轉染試劑對照的LHK2細胞。
[0075] 圖13是表示S0X2陽性乳腺癌患者和S0X2陰性乳腺癌患者的患者生存率的圖表。
[0076] 圖14:圖14a)是通過RT - PCR法研究導入了 sh- S0X2基因的細胞、導入了 sh - EGFP的細胞中S0X2基因的表達水平的結果；b)是表示將各細胞在含順鉬培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 小時時的細胞生存率用相對于順鉬濃度作圖來表示的圖表。
[0077] 圖15是表示來源于S0X2多肽的肽的HLA - A24結合分析結果的圖。將顯示與用 作陽性對照的肽同等程度或與其接近的MFI的肽鑒定為HLA - A24結合性肽。
[0078] 圖16是表示S0X2 _ 109肽的細胞毒性分析結果的圖。檢測到與作為陰性對照的 來源于HIV的肽相比顯著大的細胞毒性。
[0079] 圖17是表示S0X2 _ 109肽的酶聯(lián)免疫斑點檢測結果的圖。在作為陰性對照的來 源于HIV的肽中沒有檢測到IFN Y的放出，但在S0X2 _ 109肽中確認到IFN Y的放出。
[0080] 圖18:圖18的a)是SMCP基因導入中使用的質粒的模式圖、移植的小鼠的模式圖， b) 是移植導入有SMCP表達基因的LHK2細胞和轉染試劑對照LHK2細胞5周后的小鼠照片。 c) 是向小鼠中移植1000個導入有SMCP基因的LHK2細胞和10000個轉染試劑對照LHK2細 胞后各周中測得的腫瘤大小的圖表。圖表中，黑菱形表示強制表達SMCP基因的LHK2細胞， 黑正方形表示轉染試劑對照LHK2細胞。
[0081] 圖19:圖19的a)是通過RT - PCR法調查下述細胞中SMCP基因的表達水 平的結果，所述細胞為：2種導入針對SMCP的siRNA的細胞，和作為陰性對照的導入 了 "invitrogen 公司 Stealth RNAi (注冊商標）siRNA Negative Control Hi GC 目錄 No. 12935 - 400"的細胞。b)表示在相同條件下培養(yǎng)各細胞時細胞數(shù)變化的圖表。圖表中， 黑正方形表示陰性對照的LHK2細胞，黑三角形表示導入了 SMCPl的LHK2細胞，黑圓形表示 導入了 SMCP3的LHK2細胞。
[0082] 圖20是將200000個下述細胞移植至N0D/SCID小鼠后各周中測得的腫瘤大 小的圖表，所述細胞為：2種導入針對SMCP的siRNA的細胞，和作為陰性對照的導入 了 "invitrogen 公司 Stealth RNAi (注冊商標）siRNA Negative Control Hi GC 目錄 No. 12935 - 400"的細胞。圖表中，黑正方形表示陰性對照的LHK2細胞，黑三角形表示導入 SMCPl的LHK2細胞，黑圓形表示導入SMCP3的LHK2細胞。
[0083] 圖21是在的各組織細胞和培養(yǎng)癌細胞中的DNAJB8的RT - PCR結果。使用G3TOH 作為陽性對照。
[0084] 圖22是ACHN、MCF7和RenCa細胞的流式細胞儀解析結果、和對各癌細胞的SP和 MP的DNAJB8進行RT - PCR的結果。
[0085] 圖23是表示將RenCa的SP級分、MP級分和未分級的RenCa移植到大鼠中時時間 和腫瘤體積的關系的圖表。
[0086] 圖24:圖24的a)是質粒構建物的圖譜。正方形部分插入了 Mock、存活素和DNAJB8 的序列。b)是導入a)質粒的細胞的培養(yǎng)上清的蛋白質印跡雜交結果。
[0087] 圖25是表示投與各質粒疫苗的小鼠中移植腫瘤的體積和時間的關系的圖表。圓 形表示投與PBS來代替疫苗的小鼠（陰性對照）的結果，正方形表示投與未插入任何基因 的質粒的小鼠的結果，三角形表示投與插入了存活素的質粒的小鼠的結果，堅線表示投與 插入了 DNAJB8的質粒的小鼠的結果。
[0088] 圖26:圖26的a)是表示曝露于各肽時HLA - A24抗體的熒光變化的圖表，b)是 表不平均突光強度的圖表。
[0089] 圖27是表示轉染試劑對照ACHN細胞、和強制表達DNAJB8的ACHN細胞中SP級分 變化的圖。
[0090] 圖28是人的各成熟組織細胞、胎兒組織細胞和培養(yǎng)癌細胞中or7cl的RT - PCR 結果。使用G3PDH作為陽性對照。
[0091] 圖29是用相位差顯微鏡觀察染試劑對照Sw480細胞、穩(wěn)定表達or7cl的Sw480細 胞和用siRNA敲除or7cl的Sw480細胞形態(tài)的圖像和表示前述各細胞的or7cl的RT - PCR 結果的圖。使用G3TOH作為RT - PCR的陽性對照。
[0092] 圖30是表示對野生型Sw480細胞和用siRNA敲除or7cl的Sw480細胞的SP級分 進行流式細胞儀解析的結果圖。
[0093] 圖31是表示將轉染試劑對照Sw480細胞和穩(wěn)定表達or7cl的Sw480細胞移植到 小鼠中時腫瘤體積隨時間變化的圖表、以及表示將用siRNA敲除or7cl的細胞和使用陰性 siRNA的細胞移植到小鼠中時腫瘤體積隨時間變化的圖表。
[0094] 圖32是表示曝露于各肽時HLA - A24抗體的熒光變化的圖表。
[0095]圖33是表示使用實驗例32中已確認結合的肽進行的酶聯(lián)免疫斑點檢測的結果的 圖。
[0096]圖34是表不51Cr釋放實驗中的E/T比和殺傷率的關系的圖表。
【具體實施方式】
[0097] 以下詳細說明本發(fā)明。
[0098]本發(fā)明的分子標記為用于檢測作為檢測對象的細胞團中的腫瘤干細胞的分子標 記，其在該檢測對象所含的腫瘤干細胞中能檢測到，但在非腫瘤干細胞的癌細胞和正常細 胞中檢測不到。因此典型的是，用于從癌細胞團檢測腫瘤干細胞。進而，例如，有時采集任 意的作為檢測對象的細胞團時混入有正常細胞而變成腫瘤干細胞、非腫瘤干細胞的癌細胞 和正常細胞混雜存在的細胞團，即使這種情況下也能準確地檢測腫瘤干細胞。
[0099] 本發(fā)明中，"腫瘤干細胞"是指癌細胞中具有干細胞性質的細胞。干細胞是指即 使經(jīng)過細胞分裂也維持著分化能力的細胞。就腫瘤干細胞而言，在用Hoechst熒光染料 (H 〇echst33342)染色用流式細胞儀以UV激光（波長約350nm)為激發(fā)光進行檢測時，側群 (Side Population, SP)級分會被濃縮。SP級分是指：相對于被Hoechst突光染料染色的主 群（Main Population,MP)級分而言，介由ABC轉運體等將染料排出細胞外從而不被染色的 級分。
[0100] 本發(fā)明中，"正常細胞"是指生物體或組織的活動中具有正常功能的細胞。正常細 胞可以含有體干細胞，優(yōu)選為成熟細胞。
[0101] 本發(fā)明的分子標記優(yōu)選為在多個癌種的腫瘤干細胞共通被檢測的分子標記，在多 個癌種中能夠作為單一的標記使用。在例如來源于心臟、腦、胎盤、肺、肝臟、骨骼肌、腎臟、 胰臟、脾臟、胸腺、前列腺、精巢、卵巢、小腸、白細胞、結腸、胃、骨髓、大腸和末梢血單核細胞 等細胞或組織的多個癌種的腫瘤干細胞中共通表達，因此能進行檢測。
[0102] 進而，本發(fā)明的分子標記在非腫瘤干細胞的癌細胞和正常細胞中檢測不到。優(yōu)選 在例如來源于心臟、腦、胎盤、肺、肝臟、骨骼肌、腎臟、胰臟、脾臟、胸腺、前列腺、精巢、卵巢、 小腸、白細胞、結腸、胃、骨髓、大腸和末梢血單核細胞等中的至少1種以上非腫瘤干細胞的 癌細胞和正常細胞中檢測不到。
[0103] 本發(fā)明的分子標記能夠在腫瘤干細胞中表達或檢測，但在正常細胞中不能表達或 檢測，從而能夠在采集自含有腫瘤干細胞的細胞或組織中的任意細胞團中檢測腫瘤干細 胞。
[0104] 為了用作具有通用性的分子標記，優(yōu)選在多個癌種中能夠用作單一的標記，典型 的是，在心臟、腦、胎盤、肺、肝臟、骨骼肌、腎臟、胰臟、脾臟、胸腺、前列腺、精巢、卵巢、小腸、 白細胞、結腸、胃、骨髓、大腸和末梢血單核細胞等細胞或組織中的至少2種以上的正常細 胞中檢測不到，優(yōu)選在至少3種以上中檢測不到。最優(yōu)選在全部的細胞或組織中的正常細 胞中檢測不到。
[0105] 本說明書中，"基因的表達"是指以該基因的轉錄為起點的一系列的生物體反應， "表達產物"是指例如mRNA、內源性多肽等該一系列生物體反應所生成的分子。
[0106] 另外，本說明書中，"表達"是指能夠用例如RT - PCR、原位雜交、免疫檢驗法、色譜 法等本領域技術人員已知的方法確認到表達產物。另外，"檢測不到"是指在前述表達產物 的確認方法中無法確認到表達產物。另外，在例如RT - PCR等靈敏度極高的檢測方法中出 現(xiàn)信號似乎被檢測到但信號強度有顯著差異、在免疫檢驗法等本發(fā)明實施方式中從實用性 觀點來看具有足夠靈敏度的檢測方法的檢測水平以下等情況，這些情況在本說明書中也包 括在"檢測不到"中。
[0107] 本發(fā)明檢測的基因的表達廣物優(yōu)選為具有公知序列的基因的表達廣物，但也可以 為其同源體。優(yōu)選為具有以下mRNA或cDNA序列的基因的表達產物。
[0108] Sox2：GeneaccessionNo.NM_003106
[0109] Smcp:GeneaccessionNo.NM-030663
[0110] Intsl:GeneaccessionNo.NM-001080453
[0111] Koxl2:GeneaccessionNo.NM-152907
[0112] MdfI:GeneaccessionNo.NM-005586
[0113] FLJ13464：GeneaccessionNo.AK023526
[0114] 667J232：GeneaccessionNo.AL833225
[0115] Surf6:GeneaccessionNo.NM-006753
[0116] Pcdhl9：GeneaccessionNo.NM_001105243
[0117] Dchs2:GeneaccessionNo.NM-017639
[0118] Pcdh21:GeneaccessionNo.NM-033100
[0119] Gal3stl:GeneaccessionNo.NM-004861
[0120] Raslllb:GeneaccessionNo.NM-023940
[0121] Hes6:GeneaccessionNo.NM-018645
[0122] Znf415:GeneaccessionNo.NM-018355
[0123] Nkx2 - 5：GeneaccessionNo.NM_004387
[0124] Pamci:GeneaccessionNo.NM-005447
[0125] Pnmt:GeneaccessionNo.NM-002686
[0126] Scgb3al:GeneaccessionNo.NM-052863
[0127] 0r7cl：GeneaccessionNo.NM_198944
[0128] Dnajb8:GeneaccessionNo.NM-153330
[0129] 本發(fā)明中，判定對象優(yōu)選為人、來源于人的組織和/或來源于人的細胞，但也可以 為人以外的動物（例如，小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠等嚙齒類、黑猩猩等靈長類、牛、山羊、綿羊 等偶蹄目、馬等奇蹄目、兔子、狗、貓等）、來源于該動物的組織、和/或來源于該動物的細 胞。
[0130] 判定是指在檢測到本發(fā)明的分子標記時判定為存在腫瘤干細胞，判定對象中也可 以含有正常細胞和/或非腫瘤干細胞的癌細胞。從能夠在多個癌種中用作單一的標記的 觀點出發(fā)，優(yōu)選檢測Sox2、Smcp、Intsl、Koxl2、Mdfl、FLJ13464、667J232、Surf6、Pcdhl9、 Dchs2、Pcdh21、Gal3stl、Raslllb、Hes6、Znf415、Nkx2 - 5、Pamci、Pnmt、Scgb3al、0r7cl、 和Dnajb8的表達產物來進行判定，最優(yōu)選檢測Sox2的表達產物來進行判定。
[0131] 本發(fā)明的分子標記為mRNA時，其檢測中使用探針、引物等與mRNA特異性結合的試 劑。從檢測靈敏度高、操作簡便性等觀點出發(fā)，優(yōu)選用RT - PCR法檢測。
[0132] 本發(fā)明的分子標記為內源性多肽時，其檢測中使用抗體、配體等與肽特異性結合 的試劑。例如，抗體可以使用多克隆抗體和/或單克隆抗體。從非特異性反應更低的觀點 出發(fā)，優(yōu)選使用單克隆抗體。
[0133] 判定可以是體內或體外的判定。本說明書中，"體外的判定"是指使從生物體采集 的組織或細胞在例如培養(yǎng)液等生物體外環(huán)境中生長繁殖后進行判定。與此相對，"體內的判 定"是指在生物體內直接判定，或者從生物體采集組織或細胞后立即判定或固定后判定。組 織或細胞采集可以通過例如切開、細胞抽吸、采血、采尿等來進行，但并不僅限于此。
[0134] 在體內進行判定時，可以使用本領域技術人員公知的體內檢測法來進行。體內的 判定可以使用例如血液檢查、原位雜交、原位PCR、免疫組織染色等公知的檢測法來進行。
[0135] 在體外進行判定時，可以使用例如免疫組織染色、RT-PCR等本領域技術人員公 知的體外檢測法來進行，但不僅限于此。進行RT-PCR時，循環(huán)數(shù)優(yōu)選為30~35個循環(huán)。 在組織培養(yǎng)后的腫瘤組織中進行判定等也包括在體外的判定中。
[0136] 本發(fā)明的分子標記在腫瘤干細胞中特異性表達，因此推測其檢測量與腫瘤干細胞 的個數(shù)是相關的。因此，在投與針對對象的候補化合物的前后，如果本發(fā)明的分子標記的檢 測量減少，則這可以認為是腫瘤干細胞的個數(shù)已減少。即，通過比較投與前后的分子標記的 檢測量，能夠篩選作為針對腫瘤干細胞的候補治療藥的化合物。因此，該篩選方法也包含在 本發(fā)明中。
[0137] 另外，本發(fā)明還包含含有用于檢測上述分子標記的試劑的試劑盒。試劑盒中，例如 為了用于檢測mRNA，可含有探針、引物等特異性檢測mRNA的試劑；為了用于檢測多肽，可含 有配體、抗體等特異性檢測多肽的試劑。試劑盒中可含有至少1種以上前述試劑。試劑盒 中可含有例如反應用緩沖液、反應促進劑等適合于其使用方式的附帶試劑。
[0138] 從在多個癌