使用miRNA的癌癥療法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明總體上涉及使用微小RNA miR-7-5p治療表達1型胰島素樣生長因子受體 (IGFlR)或IGFlR信號傳導(dǎo)通路的成分的癌癥，特別是黑色素瘤的方法和組合物。還提供用 于增加這類癌癥對治療劑的敏感性的方法。
[0002] 相關(guān)申請
[0003] 本申請要求2012年10月18日提交的題為"Cancer Therapy Using miRNAs"的 澳大利亞臨時申請?zhí)?012904570的優(yōu)先權(quán)。澳大利亞臨時申請?zhí)?012904570的主題以引 用的方式整體并入本文。
【背景技術(shù)】
[0004] 黑色素瘤是最具侵襲性形式的皮膚癌并且是全世界日益增加的健康問題，發(fā)病率 呈逐年上升趨勢。一旦黑色素瘤已經(jīng)轉(zhuǎn)移，幾乎不存在有效治療，并且死亡率較高。黑色素 瘤能夠快速轉(zhuǎn)移并且經(jīng)常是常規(guī)化學(xué)療法和放射療法難治的。這種抗性是改善患者存活的 主要障礙，并且隨著有效治療劑的缺乏，需要開發(fā)新穎的、治療有效的治療方法來治療黑色 素瘤。
[0005] 對黑色素瘤的分子生物學(xué)，包括作為潛在藥物靶標(biāo)的基因突變和在黑色素瘤中 活化的特定信號傳導(dǎo)通路（如胰島素樣生長因子1受體（IGFlR)通路）的鑒定的理解 增加為開發(fā)改善的療法提供希望。IGFlR與良性痣相比在惡性黑色素瘤中過度表達并 且介導(dǎo)過程如存活、增殖和運動。IGFlR刺激導(dǎo)致兩個主要下游信號傳導(dǎo)通路的活化： PI3K-Akt_T0R通路和Ras-Raf-MEK-ERK通路，所述兩種通路對于黑色素瘤發(fā)病機制是重 要的。突變發(fā)生在這些通路的關(guān)鍵分子中，包括NRAS (9% -15%的黑色素瘤）、BRAF (66% 的黑色素瘤）和PTEN (30 % -60 %的黑色素瘤），從而導(dǎo)致所述通路的組成型活化，促進 細胞增殖、存活、迀移和侵襲。雖然使用突變體BRAF抑制劑PLX4032(RG7204/威羅菲尼 (vemurafenibVZelbora? )的最近臨床試驗已經(jīng)產(chǎn)生了轉(zhuǎn)移性黑色素瘤腫瘤的急劇收 縮，但是幾乎所有患者發(fā)展抗性。重要的是，IGFlR信號傳導(dǎo)的上調(diào)是對BRAF抑制的ERK獨 立的抗性。因此，IGFlR及其下游信號傳導(dǎo)通路是癌癥治療的潛在靶標(biāo)。
[0006] 微小RNA(miRNA)是至少部分地通過其經(jīng)由miRNA的"種子區(qū)"結(jié)合靶基因的 3' -UTR的能力調(diào)控mRNA降解和翻譯兩者的一類高度保守的小型（通常21-25個核苷酸） 非編碼RNA。miRNA是從通常包含從非編碼DNA的區(qū)域轉(zhuǎn)錄的幾百個核苷酸的RNA前體（初 始-miRNA)產(chǎn)生。初始-miRNA在細胞核中通過RNA酶III核酸內(nèi)切酶加工以形成大約70 個核苷酸的莖-環(huán)前體（前體-miRNA)。前體-miRNA被主動地轉(zhuǎn)運至細胞質(zhì)中，在細胞質(zhì) 中它們被進一步加工成通常21-23個核苷酸的短RNA雙鏈體。功能性miRNA鏈從其互補 非功能性鏈解離并且位于RNA-誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RISC)內(nèi)。（或者，RISC可直接負載前 體-miRNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)。）miRNA結(jié)合靶mRNA的:V UTR并且在所述結(jié)合中重要的是在miRNA 的5'末端附近的大約6-7個核苷酸的"種子區(qū)"（通常核苷酸位置2至8)。miRNA-誘導(dǎo) 的基因表達調(diào)控通常通過翻譯阻抑實現(xiàn)，從而在蛋白質(zhì)從核糖體或"凍結(jié)"核糖體出現(xiàn)時降 解蛋白質(zhì)、和/或促進靶mRNA移動到RNA破壞的位點。
[0007] miRNA對于許多正常細胞功能來說是重要的，并且參與過程如干細胞分裂、胚胎發(fā) 育、細胞分化、炎癥和免疫。越來越多地，特定miRNA和個體miRNA的表達模式和改變的表 達調(diào)控也被牽涉在多種疾病病狀（包括癌癥）中。miR-7-5p被表征為幾種癌癥類型中的腫 瘤抑制miRNA，其中其靶向且阻抑分子如IGFlR(胰島素樣生長因子1受體）、PAK1 (p21-活 化激酶I)、IRS-1/2 (胰島素受體底物1和2)、EGFR (表皮生長因子受體）、FAK (粘著斑激 酶）和RAFl (ν-raf-l鼠白血病病毒致癌基因同源物1)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 在第一方面，本發(fā)明提供一種用于治療表達IGFlR或IGFlR信號傳導(dǎo)通路的成分 的癌癥或腫瘤的協(xié)同組合物，所述組合物包含miR-7-5p miRNA、其前體或變體或包含含有 序列GGAAGA的種子區(qū)的miRNA，以及BRAF抑制劑、IGFlR抑制劑和DNA烷化化學(xué)治療劑中 的至少一種。
[0009] 在一個具體實施方案中，癌癥是黑色素瘤。黑色素瘤可以是惡性黑色素瘤。黑色 素瘤可包含表達BRAF、NRAS或PTEN中的一個或多個中的突變的細胞。
[0010] miR-7-5p miRNA可以是hsa-miR-7-5p，并且可包含SEQ ID NO :1中列出的核苷酸 序列。miR-7_5p miRNA 前體可選自 hsa-miR-7-l、hsa-miR-7_2 和 hsa-miR-7-3,并且可包 含如在SEQ ID No :2至4中的任一項中列出的序列。
[0011] BRAF抑制劑可以是突變體BRAF特異性抑制劑或突變體BRAF選擇性抑制劑。突變 體BRAF可包含例如V600E、V600D、V600K或V600R突變。在一個具體實施方案中，BRAF抑 制劑是PLX4032(威羅菲尼；如Zelboraf? )。在一個具體實施方案中，IGFlR抑制劑是酪氨 酸激酶抑制劑，并且可選自苦鬼臼脂素（picropodophyllin) (PPP)和NVP-AEW541。在一個 具體實施方案中，化學(xué)治療劑是替莫唑胺（TMZ ;如Temodar?)。
[0012] 本發(fā)明的第二方面提供一種用于治療受試者中的表達IGFlR或IGFlR信號傳導(dǎo) 通路的成分的癌癥或腫瘤的方法，所述方法包括向所述受試者施用協(xié)同有效量的miR-7-5p miRNA、其前體或變體或包含含有序列GGAAGA的種子區(qū)的miRNA，以及選自BRAF抑制劑、 IGFlR抑制劑和DNA烷化化學(xué)治療劑的至少一種治療劑。
[0013] 所述治療劑和miRNA可以單一組合物施用，與藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或佐 劑一起配制或可以分開的組合物施用。在一個實施方案中，所述方法包括向所述受試者施 用有效量的第一方面的組合物。當(dāng)藥劑分開施用時，可同時或順序施用。在具體實施方案 中，施用miRNA使得癌癥易感于低于在不存在miRNA的情況下所需的細胞生長抑制或細胞 毒性劑量的治療劑的細胞生長抑制或細胞毒性劑量。因此，當(dāng)順序施用時，通常在治療劑之 前施用miRNA。
[0014] 本發(fā)明的第三方面提供一種用于使表達IGFlR或IGFlR信號傳導(dǎo)通路的成分的癌 癥或腫瘤細胞對選自BRAF抑制劑、IGFlR抑制劑和DNA烷化化學(xué)治療劑的治療劑敏感的方 法，所述方法包括使所述細胞與有效量的miR-7-5p miRNA、其前體或變體或包含含有序列 GGAAGA的種子區(qū)的miRNA相接觸。
[0015] 所述癌癥或腫瘤細胞或所述細胞所源自的癌癥或腫瘤在不存在治療的情況下可 展示對治療劑的抗性。所展示的抗性可以是固有抗性或獲得性抗性。
[0016] 通常，敏化作用使得細胞易感于低于在不存在miRNA的情況下所需的細胞生長抑 制或細胞毒性劑量的治療劑的細胞生長抑制或細胞毒性劑量。
[0017] 本發(fā)明的第四方面提供一種用于抑制或預(yù)防癌癥轉(zhuǎn)移或癌細胞迀移的方法，其中 所述癌癥表達IGFlR或IGFlR信號傳導(dǎo)通路的成分，所述方法包括向有需要的受試者施用 有效量的miR-7-5p miRNA、其前體或變體或包含含有序列GGAAGA的種子區(qū)的miRNA。
[0018] 通常，根據(jù)上述方面和實施方案，所述miRNA抑制胰島素受體底物2(IRS-2)、 P21-活化的激酶I(PAKl)和粘著斑激酶（FAK)中的一種或多種的表達。
[0019] 本文還提供miR-7-5p miRNA、其前體或變體或包含含有序列GGAAGA的種子區(qū)的 miRNA以及選自BRAF抑制劑、IGFlR抑制劑和化學(xué)治療劑的至少一種治療劑用于治療表達 IGFlR或IGFlR信號傳導(dǎo)通路的成分的癌癥或腫瘤的用途。
[0020] 本文還提供miR-7-5p miRNA、其前體或變體或包含含有序列GGAAGA的種子區(qū)的 miRNA用于使表達IGFlR或IGFlR信號傳導(dǎo)通路的成分的癌癥或腫瘤細胞對選自BRAF抑制 劑、IGFlR抑制劑和DNA烷化化學(xué)治療劑的治療劑敏感的用途。
[0021] 本文還提供miR-7-5p miRNA、其前體或變體或包含含有序列GGAAGA的種子區(qū)的 miRNA用于抑制或預(yù)防癌癥轉(zhuǎn)移或癌細胞迀移的用途，其中所述癌癥表達IGFlR或IGFlR信 號傳導(dǎo)通路的成分。
【附圖說明】
[0022] 本發(fā)明的實施方案僅通過非限制性實施例參考以下圖進行了描述。
[0023] 圖I. miR-7-5p降低IGFlR通路的分子的表達并且消除在黑色素瘤細胞中信號傳 導(dǎo)的Akt和ERK1/2的活化。使用從用15nM的miR-NC或miR-7-5p前體轉(zhuǎn)染的SK-MEL-28、 WM266-4、MM96L和A2058黑色素瘤細胞系收獲的蛋白質(zhì)提取物免疫印跡檢測所指示的蛋白 質(zhì)（在轉(zhuǎn)染后3天）。β-肌動蛋白，上樣對照。數(shù)據(jù)代表三個獨立實驗。
[0024] 圖2.miR-7-5p降低黑色素瘤細胞存活力。Α.用所指示濃度的miR-NC或miR-7-5p 前體轉(zhuǎn)染后5天MM96L細胞存活力的細胞滴度分析。B.如A中轉(zhuǎn)染A2058細胞并且分析 細胞存活力。數(shù)據(jù)已被標(biāo)準(zhǔn)化至僅Lipofectamine 2000(媒介物）并且代表三個獨立的實 驗。條形代表S. D.，**指示與miR-NC(p < 0· 01)的顯著差異，并且林*指示與miR-NC(p < 0. 001)的顯著差異。
[0025] 圖3.黑色素瘤細胞系對IGFlR激酶抑制劑NVP-AEW541具有抗性并且miR-7-5p可 使黑色素瘤細胞系對BRAF抑制劑、IGFlR抑制劑和DNA烷化化學(xué)治療劑敏感。A.將A2058、 MM96L和MCF-7 (陽性對照）用一定濃度范圍內(nèi)（0. 001-100 μ M)的NVP-AEW541處理并且在 4天之后分析細胞存活力。數(shù)據(jù)已被標(biāo)準(zhǔn)化至最低藥物濃度。條形表示細胞存活力的平均 差異土 S.D.。數(shù)據(jù)代表三個獨立實驗。Β-Ε.將Α2058細胞用5ηΜ下的miR-NC或miR-7-5p 前體轉(zhuǎn)染并且在轉(zhuǎn)染后3天用所指示的藥物（Β，5μΜ NVP-AEW541;C，100nM PLX4032;D， IOOnM PPP ;E，150 μ M TMZ)或DMSO處理。數(shù)據(jù)表示在添加藥物或DMSO之后4天的細胞存 活力（轉(zhuǎn)染后7天）。數(shù)據(jù)已被標(biāo)準(zhǔn)化至用DMSO處理的miR-NC并且代表至少兩個獨立的 實驗。條形代表S. D.，*#指示與miR-NC(p < 0. 001)的顯著差異，f指示miR-7-5p與所 指示的藥物處理之間的協(xié)同作用。
[0026] 圖4. miR-7_5p抑制黑色素瘤細胞迀移并且阻斷幾種促迀移分子的表達。A.將 A2058細胞用30nM下的miR-NC或miR-7-5p前體轉(zhuǎn)染并且在48小時之后接種到CM-板 16中并且用xCELLigence RTCA DP儀器監(jiān)測迀移持續(xù)24小時。數(shù)據(jù)表示平均細胞指數(shù) 土 S.D.。數(shù)據(jù)代表三個獨立實驗。B.將WM266-4和A2058細胞如A中進行轉(zhuǎn)染并且在相同 時間點收獲蛋白質(zhì)用于迀移測定。通過免疫印跡檢測FAK、IRS-2和PAKl的蛋白質(zhì)表達的 變化。β肌動蛋白，上樣對照。數(shù)據(jù)代表三個獨立實驗。
[0027] 圖5. miR-7-5p抑制Α2058、WM266-4和Α375黑色素瘤細胞迀移。在用miR-7-5p 或miR-NC轉(zhuǎn)染之后A2058、WM266-4和A375黑色素瘤細胞系的迀移（由細胞指數(shù)表示）的 實時xCELLigence分析。
[0028] 圖6. miR-7-5p抑制A2058、WM266-4和A375黑色素瘤細胞侵襲。在用miR-7-5p 或miR-NC轉(zhuǎn)染之后A2058、WM266-4和A375黑色素瘤細胞系的侵襲（由細胞指數(shù)表示）的 實時xCELLigence分析。
[0029] 圖7.miR-7-5p抑制1205LU黑色素瘤細胞迀移和侵襲。A.在用miR-7-5p或miR-NC 轉(zhuǎn)染之后1205Lu黑色素瘤細胞系的迀移（由細胞指數(shù)表示）的實時xCELLigence分析。 B.在用miR-7-5p或miR-NC轉(zhuǎn)染之后1205LU黑色素瘤細胞系的侵襲（由細胞指數(shù)表示） 的實時xCELLigence分析。
[0030] 圖8. IRS-2是黑色素瘤細胞系中的miR-7-5p的靶標(biāo)。A.在用miR-7-5p或miR-NC 轉(zhuǎn)染W(wǎng)M266-4和A2058細胞之后72小時IRS-2、P-IRS-2和β -肌動蛋白表達的蛋白質(zhì)免 疫印跡。光密度測定法用于定量泳帶強度（每個泳帶下方所示的值）。Β.在用miR-7-5p 或miR-NC轉(zhuǎn)染W(wǎng)M266-