可在許多情況下是適合和方便的給藥途徑。
[0085] 一般來說，適合的組合物可根據本領域的普通技術人員已知的方法進行制備并且 可包含藥學上可接受的稀釋劑、佐劑和/或賦形劑。稀釋劑、佐劑和賦形劑在可與組合物的 其它成分相容以及不對其接受者有害的意義上必須是"可接受的"。
[0086] 適于局部施用的組合物可呈任何適合的形式，配制為例如搽劑、洗劑、乳膏、凝膠、 軟膏或糊劑。藥學上可接受的稀釋劑的實例是脫礦質或蒸餾水；鹽水溶液；基于植物的油， 如花生油、紅花油、橄欖油、棉子油、玉米油、芝麻油、花生油或椰子油；硅油，包括聚硅氧烷， 如聚甲基硅氧烷、聚苯基硅氧烷和聚甲基苯基硅氧烷；揮發(fā)性娃酬；礦物油，如液體石賭、 軟石蠟或角鯊烷；纖維素衍生物如甲基纖維素、乙基纖維素、羧甲基纖維素、羧甲基纖維素 鈉或羥丙基甲基纖維素；低級烷醇，例如乙醇或異丙醇；低級芳烷醇；低級聚亞烷基二醇或 低級亞烷基二醇，例如聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇、丙二醇，1，3-丁二醇或甘油；脂肪酸酯 如棕櫚酸異丙酯、肉豆蔻酸異丙酯或油酸乙酯；聚乙烯基吡咯烷酮；瓊脂；角叉菜膠；黃蓍 膠或阿拉伯膠以及凡士林。通常，一種或多種載體將形成1重量％至99. 9重量％的組合物。 [0087] 組合物還可被浸入透皮貼片、石膏和傷口敷料，如繃帶或水膠體敷料，優(yōu)選地呈液 體或半液體形式。
[0088] 為了作為可注射溶液或懸浮液施用，無毒胃腸外可接受的稀釋劑或載體可包括林 格氏溶液、中鏈甘油三酯（MCT)、等滲鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水、乙醇和1，2丙二醇。用于口服 使用的適合的載體、稀釋劑、賦形劑和佐劑的一些實例包括花生油、液體石蠟、羧甲基纖維 素鈉、甲基纖維素、海藻酸鈉、阿拉伯膠、黃蓍膠、葡萄糖、鹿糖、山梨醇、甘露醇、明膠和卵磷 月旨。此外，這些口服制劑可含有適合的調味劑和著色劑。當以膠囊形式使用時，膠囊可包覆 有延遲崩解的化合物如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
[0089] 佐劑通常包括軟化劑、乳化劑、增稠劑、防腐劑、殺菌劑和緩沖劑。
[0090] 用于口服施用的固體形式可含有在人和獸醫(yī)藥學實踐中可接受的粘合劑、甜味 劑、崩解劑、稀釋劑、調味劑、包覆劑、防腐劑、潤滑劑和/或延時劑。適合的粘合劑包括阿拉 伯膠、明膠、玉米淀粉、黃蓍膠、藻酸鈉、羧甲基纖維素或聚乙二醇。適合的甜味劑包括蔗糖、 乳糖、葡萄糖、阿斯巴甜或糖精。適合的崩解劑包括玉米淀粉、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷 酮、瓜爾膠、黃原膠、膨潤土、藻酸或瓊脂。適合的稀釋劑包括乳糖、山梨醇、甘露醇、葡萄糖、 高嶺土、纖維素、碳酸鈣、硅酸鈣或磷酸二鈣。適合的調味劑包括薄荷油、冬青油、櫻桃、橙子 或覆盆子調味劑。適合的包覆劑包括丙烯酸和/或甲基丙烯酸和/或其酯的聚合物或共聚 物、蠟、脂肪醇、玉米蛋白、蟲膠或谷蛋白。適合的防腐劑包括苯甲酸鈉、維生素Ε、α-生育 酚、抗壞血酸、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯或亞硫酸氫鈉。適合的潤滑劑包括硬 脂酸鎂、硬脂酸、油酸鈉、氯化鈉或滑石。適合的延時劑包括單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘 油酯。
[0091] 除了上述藥劑以外，用于口服施用的液體形式還可含有液體載體。適合的液體載 體包括水，油如橄欖油、花生油、芝麻油、葵花油、紅花油、花生油、椰子油、液體石蠟、乙二 醇、丙二醇、聚乙二醇、乙醇、丙醇、異丙醇、甘油、脂肪醇、甘油三酯或其混合物。
[0092] 用于口服施用的懸浮液還可包括分散劑和/或懸浮劑。適合的懸浮劑包括羧甲基 纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、藻酸鈉或鯨蠟醇。適合的分 散劑包括卵磷脂，脂肪酸如硬脂酸的聚氧乙烯酯，聚氧乙烯脫水山梨糖醇單-或二-油酸 酯、-硬脂酸酯或-月桂酸酯，聚氧乙烯脫水山梨糖醇單-或二-油酸酯、-硬脂酸酯或-月 桂酸醋等。
[0093] 用于口服施用的乳液還可包含一種或多種乳化劑。適合的乳化劑包括如上文例舉 的分散劑或天然樹膠，如瓜爾膠、阿拉伯膠或黃蓍膠。
[0094] 用于制備可胃腸外施用的組合物的方法對于本領域技術人員來說是清楚的，并且 更詳細描述于例如 Remington' s Pharmaceutical Science，第 15 版，Mack Publishing Company，Easton，Pa.中，特此以引用的方式并入本文。所述組合物可并入任何適合的表面 活性劑如陰離子型、陽離子型或非離子型表面活性劑，如脫水山梨糖醇酯或其聚氧乙烯衍 生物。還可包括懸浮劑（如天然樹膠、纖維素衍生物）或無機材料（如硅酸鹽質硅石）和 其它成分（如羊毛脂）。
[0095] 用于制備藥物組合物的方法和藥物載體是本領域中熟知的，如在教科書如 Remington' s Pharmaceutical Sciences，第20版，Williams&Wilkins，Pennsylvania，USA 中所列出。載體將取決于施用途徑，并且再次本領域的技術人員將能夠容易地確定針對每 個具體病例的最適合的制劑。
[0096] 所述組合物還可以脂質體形式施用。脂質體通常源自磷脂或其它脂質物質，并且 通過分散于水性介質中的單層或多層水合液體晶體形成?？墒褂媚軌蛐纬芍|體的任何無 毒、生理學上可接受和可代謝的脂質。脂質體形式的組合物可含有穩(wěn)定劑、防腐劑、賦形劑 等。優(yōu)選的脂質是磷脂和磷脂酰膽堿（卵磷脂），天然的和合成的。用于形成脂質體的方法 是本領域中已知的，并且關于此具體參考：Prescott，編輯，Methods in Cell Biology，第 XIV卷，Academic Press，New York，N.Y. (1976)，第33頁以及下列等等，所述文獻的內容以 引用的方式并入本文。
[0097] 在本說明書中對任何現有出版物（或源自其的信息）或對任何已知內容的引用， 不被并且不應被認為是認同、承認或任何形式的暗示所述現有出版物（或源自其的信息） 或已知內容形成本說明書所涉及致力領域的公知常識的一部分。
[0098] 現將參考以下具體實施例描述本發(fā)明，所述實施例不應被解釋為以任何方式限制 本發(fā)明的范圍。
[0099] 實施例
[0100] 以下實施例說明本發(fā)明并且不應被解釋為以任何方式限制貫穿本說明書的描述 的本公開的總體性質。
[0101] 一般方法
[0102] 化學品和試劑
[0103] NVP-AEW541 (Cayman Chemical，Ann Arbor，MI)和苦鬼白脂素（PPP ;Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)被制備為二甲亞諷（DMSO) (Sigma-Aldrich ;Sydney， Australia)中的 IOmM 儲備溶液。替莫挫胺（TMZ;Sigma_Aldrich)和 PLX4032(Selleck Chemicals，Houston，TX)分別被制備為DMSO中的50mM和IOOmM儲備溶液。出于實驗目的， 在添加至細胞培養(yǎng)物之前將藥物稀釋在新鮮培養(yǎng)基中。將對應于人miR-7-5p的合成miRNA 前體分子（前體-miR miRNA 前體產品編號：PM10047) (Ambion ;Victoria，Australia) 和陰性對照miRNA (miR-NC ;前體-miR miRNA前體陰性對照#1，產品編號：AM17110) (Ambion)制備為不含RNA酶的水（Ambion)中的50 μ M儲備溶液。在測試miR-7-5p和/ 或藥物的作用的實驗中，將媒介物對照細胞培養(yǎng)物用DMSO (代替藥物）或Lipofectamine 2000 (Invitrogen ;Victoria，Australia)(代替 miR-7_5p 和 miR-NC)的等效 v/v 稀釋液進 行處理。
[0104] 細胞系和細胞培養(yǎng)物
[0105] WM266-4、A375和SK-MEL-28黑色素瘤細胞是自美國典型培養(yǎng)物保藏所（ATCC)獲 得。MM96L和A2058黑色素瘤細胞由西澳醫(yī)學研宄所（Western Australian Institute for Medical Research) (WAMR)的 Peter Klinken 教授惠贈。將 WM266-4、SK-MEL-28、MM96L 和 八2058細胞在37°0下在5%0)2中用補充有10%胎牛血清$85)的1?^11640培養(yǎng)基進行培 養(yǎng)。IGFlR抑制劑敏感性乳腺癌細胞系（MCF-7)是自ATCC獲得并且在37°C下在5%0) 2中 用補充有10 % FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。穩(wěn)定地表達Q61 NRAS突變體基因的BRAF 抑制劑抗性黑色素瘤細胞A375和WM266-4由彼得?麥卡倫癌癥中心（Peter MacCallum Cancer Centre)的Grant McArthur副教授惠贈。1205Lu黑色素瘤細胞由昆士蘭大學迪亞 曼蒂納研宄所（University of Queensland Diamantina Institute)的 Nikolas Haas 副 教授惠贈。
[0106] 藥物敏感性測定
[0107] 將細胞以2. 5X IO3個細胞/孔的密度接種在96孔板中并且在過夜孵育之后，用一 定濃度范圍的藥物進行處理。在4天之后按照制造商的說明書使用CellTitre 96Aqueous One Solution 細胞增殖測定試劑盒（Promega ;Sydney，Australia)和 FLUOstar OPTIMA 酶 標儀（BMG Labtech ;Victoria，Australia)測量細胞存活力。
[0108] miRNA 前體和 siRNA 轉染
[0109] 將最佳細胞數目使用 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)用 miR-7_5p (SEQ ID NO :1 ;由 Ambion 合成）或 miR-NC 前體分子（下文 "miR-NC" ;AmbionAM17110)以 1-30ηΜ 范圍的最終濃度進行轉染。對于siRNA轉染，將沉默子選擇siRNA(Invitrogen)陰性對照 1 號（si-NC ;4390843)、si-IRS-2#l(sl6486)、si-IRS-2#2(sl6487)使用 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)根據制造商的方案進行轉染。細胞在24小時之后收獲用于RNA提取或 在轉染之后2-3天收獲用于蛋白質提取。
[0110] 蛋白質提取
[0111] 用含有細胞質提取物緩沖液（CEB)的PhosSTOP磷酸酶抑制劑（Roche ;New South WaleS，Australia)和不含EDTA的完全蛋白酶抑制劑（Roche)收獲蛋白質。將細胞溶解產 物在-80°C下冷凍過夜，通過在13, OOOXg下離心5分鐘澄清并且收集上清液。根據制造 商的說明書通過Bio-Rad蛋白質測定（Bio-Rad ;New South Wales，Australia)并且使用 FLUOstar OPTIMA酶標儀測定總單蛋白質濃度。
[0112] 蛋白質印跡
[0113] 將 15 yg 的總蛋白質樣品在 NuPAGE NOVEX 4 % -12 % Bis-Tris 凝膠 (Invitrogen)上進行解析并且轉移至聚偏二氟乙?。≒VDF)蛋白質印跡膜（Roche)。將印 跡用 Odyssey 封閉緩沖液（Millennium Science，Victoria，Australia)封閉 1 小時并且在 4°C下用抗-IGF1R、抗-磷酸基-IGF1R、抗-IRS-1、抗-IRS-2、抗-磷酸基-IRS-2、抗-ERK 1/2、抗-磷酸基-ERK 1/2、抗-Akt、抗-磷酸基-Akt (Ser-473)、抗-PAKl (全部來自 Cell Signaling Technology，Beverly，MA)或抗-FAK(Santa Cruz Biotechnology)、抗-磷酸 基-11^-2(361-731;413〇3111，〇31]1131^(^6，嫩）或抗-|3-肌動蛋白（413〇3111)孵育過夜，接著用 紅外綴合的第二抗體在室溫下孵育1小時。將所述膜用Odyssey SA掃描儀進行掃描以便 可視化蛋白質表達（LICOR Biosciences，Lincoln，NE)。
[0114] 細胞存活力測定
[0115] 將細胞以2. 5X IO3個細胞/孔的密度接種在96孔板中并且如上用miRNA前體分 子轉染。在轉染后5天使用CellTitre 96Aqueous One Solution細胞增殖測定試劑盒（MTS 測定）和FLUOstar OPTIMA酶標儀測量細胞存活力。對于藥物與miR-7-5p之間的協(xié)同作 用分析，將細胞如上接種并且在用miR-7-5p或miR-NC轉染4天之后3天添加藥物或DMS0， 此時測量細胞存活力（在轉染之后7天）。
[0116] 細胞迀移和侵襲測定
[0117] 用實時細胞分析儀雙板（RTCA DP)xCELLigence 系統(tǒng)（Roche Appli