用于抵消因子Xa抑制的組合物和方法
【專利說明】
[0001] 相關(guān)申請的奪叉引用
[0002] 本申請要求于2013年1月31日提交的美國臨時申請?zhí)?1/759, 332的利益，所述 美國臨時申請的內(nèi)容整體援引加入本文。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 根據(jù)37CFR § 1. 821，以計算機可讀形式（CRF)經(jīng)由EFS-Web作為文件名 PC072006_SEQLIST_ST25. txt同時提交的序列表援引加入本文。序列表的電子拷貝于2013 年12月18日創(chuàng)建，具有7千字節(jié)的文件大小。
【背景技術(shù)】
[0004] 藥理學(xué)抗凝是患有血栓前狀況的患者的治療主體。過去五十年，唯一可用的經(jīng)口 抗凝血藥是華法林，維生素 K環(huán)氧化物還原酶（VKOR)的抑制劑，其再利用氧化的維生素 K。 華法林具有許多缺點，包括無法預(yù)測的藥物代謝動力學(xué)，其需要頻繁監(jiān)控凝血參數(shù)和劑量 調(diào)整。然而，在緊急出血或需要急診手術(shù)的情況下，存在允許快速和完全逆轉(zhuǎn)的解毒藥。
[0005] 經(jīng)口直接FXa抑制劑是新出現(xiàn)的抗凝血藥，當(dāng)與標(biāo)準(zhǔn)治療例如華法林相比較時， 其具有簡化患有血栓前疾病的給藥方案和止血監(jiān)控的潛力。盡管這些藥物具有許多超過華 法林的優(yōu)點，但這些新型抗凝血藥沒有完全有效的逆轉(zhuǎn)試劑。
[0006] 然而，由于害怕難控制的出血，對其效應(yīng)的特異性對抗措施的缺乏是關(guān)鍵的未滿 足的臨床需要，其可以限制這些試劑的廣泛采用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 通過提供用于抵消直接活化因子X(FXa)抑制劑的效應(yīng)的組合物和方法，申請人 已解決該關(guān)鍵的未滿足的臨床需要。
[0008] 根據(jù)一些實施方案，本公開提供了通過施用包含因子Xa變體的組合物，用于降低 或預(yù)防用直接因子Xa (FXa)抑制劑治療的對象中的出血的方法，所述因子Xa變體含有至少 一種修飾，包括在位置16處（使用胰凝乳蛋白酶編號系統(tǒng)）使用Thr、Leu、Phe、Asp或Gly 取代野生型氨基酸，或者在位置17處（使用胰凝乳蛋白酶編號系統(tǒng)）使用Leu、Ala或Gly 取代野生型氨基酸。在某些實施方案中，用包含F(xiàn)Xa變體的組合物治療導(dǎo)致出血降低至少 50%。根據(jù)某些實施方案，直接因子Xa抑制劑包括利伐沙班或阿哌沙班。在一些實施方案 中，直接FXa抑制劑的血漿濃度通常為治療量或超治療量。例如，在一些實施方案中，利伐 沙班的血漿濃度可以是約500nM或更高，并且阿哌沙班的血漿濃度可以是約250nM或更高。 根據(jù)某些實施方案，F(xiàn)Xa變體含有取代I16L。在一些實施方案中，在比因子Xa抑制劑的血 漿濃度低至少100倍的血漿濃度下，F(xiàn)Xa變體能夠抵消直接因子Xa抑制劑的效應(yīng)。在一些 實施方案中，包含F(xiàn)Xa變體的組合物在計劃的手術(shù)前、在損傷后、或者在用直接FXa抑制劑 的有意或意外藥物過量后施用。在一些實施方案中，在用FXa變體的第一個劑量后，使用止 血測定監(jiān)控對象中的止血，并且如果通過預(yù)定時間未獲得足夠的止血，則施用FXa變體的 至少一次第二個劑量，以實現(xiàn)充分止血。根據(jù)一些實施方案，預(yù)定時間是施用FXa變體的第 一個劑量后約15分鐘、30分鐘、45分鐘或60分鐘。其他時間也是可能的。在一些其他實 施方案中，除FXa變體之外還施用至少第二種促凝血劑，包括例如不同的FXa變體、因子IX、 因子XIa、因子Xlla、因子VIII、因子Vila、FEIBA或凝血酶原復(fù)合物濃縮劑（PCC)。
[0009] 根據(jù)一些實施方案，本公開提供了通過施用包含因子Xa變體的組合物，用于增加 用直接因子Xa(FXa)抑制劑治療的對象中，響應(yīng)外源或固有凝血途徑的活化而產(chǎn)生的凝血 酶量的方法，所述因子Xa變體含有至少一種修飾，包括在位置16處（使用胰凝乳蛋白酶編 號系統(tǒng)）使用Thr、Leu、Phe、Asp或Gly取代野生型氨基酸，或者在位置17處（使用胰凝 乳蛋白酶編號系統(tǒng)）使用Leu、Ala或Gly取代野生型氨基酸。根據(jù)某些實施方案，直接因 子Xa抑制劑包括利伐沙班或阿哌沙班。在一些實施方案中，直接FXa抑制劑的血漿濃度 通常為治療量或超治療量。例如，在一些實施方案中，利伐沙班的血漿濃度可以是約500nM 或更高，并且阿哌沙班的血漿濃度可以是約250nM或更高。根據(jù)某些實施方案，F(xiàn)Xa變體含 有取代I16L。根據(jù)某些實施方案，所產(chǎn)生的凝血酶量增加約5%、10%、15%、20%、30%、 40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、150%、200%或更多。在一些實施方案中，F(xiàn)Xa 變 體能夠在比因子Xa抑制劑的血漿濃度低至少100倍的血漿濃度下抵消直接因子Xa抑制劑 的效應(yīng)。在一些實施方案中，包含F(xiàn)Xa變體的組合物在計劃的手術(shù)前、在損傷后、或者在用 直接FXa抑制劑的有意或意外藥物過量后施用。在一些實施方案中，在用FXa變體的第一 個劑量后，使用止血測定監(jiān)控對象中的止血，并且如果通過預(yù)定時間未獲得足夠的止血，則 施用FXa變體的至少一次第二個劑量，以實現(xiàn)充分止血。根據(jù)一些實施方案，預(yù)定時間是施 用FXa變體的第一個劑量后約15分鐘、30分鐘、45分鐘或60分鐘。其他時間也是可能的。 在一些其他實施方案中，除FXa變體之外還施用至少第二種促凝血劑，包括例如不同的FXa 變體、因子IX、因子XIa、因子Xlla、因子VIII、因子Vila、FEIBA或凝血酶原復(fù)合物濃縮劑 (PCC) 〇
[0010] 根據(jù)一些實施方案，本公開提供了通過施用包含因子Xa變體的組合物，用于減少 用直接因子Xa (FXa)抑制劑治療的對象中的凝血時間（如例如使用PT或INR、或一些其他 測定測量的）的方法，所述因子Xa變體含有至少一種修飾，包括在位置16處（使用胰凝乳 蛋白酶編號系統(tǒng)）使用Thr、Leu、Phe、Asp或Gly取代野生型氨基酸，或者在位置17處（使 用胰凝乳蛋白酶編號系統(tǒng)）使用Leu、Ala或Gly取代野生型氨基酸。根據(jù)某些實施方案， 直接因子Xa抑制劑包括利伐沙班或阿哌沙班。在一些實施方案中，直接FXa抑制劑的血漿 濃度通常為治療量或超治療量。例如，在一些實施方案中，利伐沙班的血漿濃度可以是約 500nM或更高，并且阿哌沙班的血漿濃度可以是約250nM或更高。根據(jù)某些實施方案，F(xiàn)Xa變 體含有取代I16L。根據(jù)某些實施方案，凝血時間減少約5%、10%、15%、20%、30%、40%、 50 %、60 %、70 %、80 %、90 %或更多。在一些實施方案中，F(xiàn)Xa變體能夠在比因子Xa抑制劑 的血漿濃度低至少100倍的血漿濃度下抵消直接因子Xa抑制劑的效應(yīng)。在一些實施方案 中，包含F(xiàn)Xa變體的組合物在計劃的手術(shù)前、在損傷后、或者在用直接FXa抑制劑的有意或 意外藥物過量后施用。在一些實施方案中，在用FXa變體的第一個劑量后，使用止血測定監(jiān) 控對象中的止血，并且如果通過預(yù)定時間未獲得足夠的止血，則施用FXa變體的至少一次 第二個劑量，以實現(xiàn)充分止血。根據(jù)一些實施方案，預(yù)定時間是施用FXa變體的第一個劑量 后約15分鐘、30分鐘、45分鐘或60分鐘。其他時間也是可能的。在一些其他實施方案中， 除FXa變體之外還施用至少第二種促凝血劑，包括例如不同的FXa變體、因子IX、因子XIa、 因子Xlla、因子VIII、因子Vila、FEIBA或凝血酶原復(fù)合物濃縮劑（PCC)。
【附圖說明】
[0011] 圖IA-B顯示了利伐沙班對游離Wt-FXa或FXa116M^抑制。A) Wt-FXa (2nM)或B) FXaI16\6nM)對肽基底物（SpecXa ;200uM)水解的初速度在增加濃度的利伐沙班下進行測 定。Ki值在每個圖上給出。
[0012] 圖2A-B顯示了在凝血酶原酶中裝配的Wt-FXa或FXaIia的利伐沙班抑制。 在 PCPS (20uM)和 FVa (40nM)的存在下，A) Wt-FXa (2nM)或 B) FXaI16L ^nM)對肽基底物 (SpecXa ;200uM)水解的初速度在增加濃度的利伐沙班下進行測定。
[0013] 圖3顯示了不同濃度的FXa11f^t逆轉(zhuǎn)利伐沙班的凝血酶生成效應(yīng)的作用。
[0014] 圖4A-D顯示了 FXa116^逆轉(zhuǎn)利伐沙班的效應(yīng)的作用。在增加濃度的FXa 116啲存 在和不存在下，正常人血漿與500nM利伐沙班一起溫育。在數(shù)據(jù)分析后，標(biāo)繪生成的峰凝血 酶（A和C)和總凝血酶（ETP ;B和D)。
[0015] 圖5A-B顯示了 FXa116^I轉(zhuǎn)高劑量利伐沙班的效應(yīng)。在增加濃度的FXa 116他存在 和不存在下，正常人血漿與7. 5uM利伐沙班一起溫育。在數(shù)據(jù)分析后，標(biāo)繪生成的峰凝血酶 (A)和總凝血酶（ETP ;B)。
[0016] 圖6A-B顯示了 FXaI16L或FXaI16T逆轉(zhuǎn)250nM阿哌沙班的效應(yīng)。在增加濃度的FXaI16L 或FXaI16T的存在和不存在下，正常人血漿與250nM阿哌沙班一起溫育。在數(shù)據(jù)分析后，標(biāo)繪 生成的峰凝血酶（A)和總凝血酶（ETP ;B)。
[0017] 圖7A-B顯示了 FXa116^tFXaI16T逆轉(zhuǎn)高劑量阿哌沙班的效應(yīng)。在增加濃度的FXallf^ 或FXa I16T的存在和不存在下，正常人血漿與2. OuM阿哌沙班一起溫育。在數(shù)據(jù)分析后，標(biāo)繪 生成的峰凝血酶（A)和總凝血酶（ETP ;B)。
[0018] 圖8A-B顯示了 FXaI16^$正在利伐沙班的存在下的全血凝固。全血血栓彈力圖用 于評價FXallf^逆轉(zhuǎn)典型㈧和高⑶劑量利伐沙班效應(yīng)的能力。
[0019] 圖9A-B顯示了 FXa116^正在阿哌沙班的存在下的全血凝固。全血血栓彈力圖用 于評價FXallf^逆轉(zhuǎn)典型㈧和高⑶劑量阿哌沙班效應(yīng)的能力。
[0020] 圖10A-B顯示了 FXa116%^凝血酶生成測定中抵消利伐沙班。圖IOA顯示了利伐沙 班的劑量應(yīng)答，并且圖IOB顯示了在利伐沙班的存在下，F(xiàn)Xa 1161的劑量應(yīng)答。
[0021] 圖11顯示了 FXa116^E小鼠尾部修剪出血模型中抵消利伐沙班。
[0022] 圖12證實了施用于小鼠的利伐沙班延遲使用ROTEM測量的全血的凝固時間，并且 用FXa llf^的施用劑量應(yīng)答性抵消利伐沙班的效應(yīng)。
[0023] 圖13顯示了施用于小鼠的利伐沙班阻止在通過激光引起的提睪肌中的血管損傷 部位處的血塊形成，并且FXa lia的施用抵消利伐沙班的效應(yīng)。使用活體顯微鏡檢查以及針 對纖維蛋白和血小板的熒光標(biāo)記的抗體，顯現(xiàn)血塊形成。圖13A顯示了在未經(jīng)處理的小鼠 中的血塊形成。圖13B顯示了利伐沙班延遲且降低血小板累積且阻止纖維蛋白沉積。相比 之下，圖13C顯示了在施用利伐沙班和FXa 116M^小鼠中，在損傷部位處發(fā)生血塊形成。
[0024] 圖14是野生型人因子X前蛋白的氨基酸序列（SEQ ID NO: 1)。信號肽對應(yīng)于氨基 酸1-23。前肽對應(yīng)于氨基酸24-40?；罨蜃覺(FXa)的成熟輕鏈對應(yīng)于氨基酸41-179。 活化FXa的成熟重鏈（在活化肽去除后）對應(yīng)于氨基酸235-488。活化肽（AP)對應(yīng)于氨基 酸 183-234。
[0025] 圖15是編碼野生型人因子X前蛋白的cDNA的核苷酸序列（SEQ ID NO: 2)。編碼 序列對應(yīng)于核苷酸58-1524。
【具體實施方式】
[0026] 本公開提供了用于抵消有此需要的對象中的直接FXa抑制劑的抗凝效應(yīng)的組合 物和方法。申請人已發(fā)現(xiàn)某些FXa變體以劑量依賴性方式快速且完全抵消直接FXa抑制劑 的效應(yīng)。更具體而言，申請人已發(fā)現(xiàn)在以治療濃度且甚至是超治療濃度的FXa抑制劑的存 在下，相對少量的FXa變體在體內(nèi)恢復(fù)正常凝血活性。通過提供快速和有效的直接FXa抑 制劑的抗凝效應(yīng)的解毒藥，申請人的公開因此促成實現(xiàn)這些有利的抗凝血藥的承諾。
[0027] 凝血因子X(FX)是酶原，其在通過固有因子IX/因子VIII或外源途徑（組織因子 /因子Vila)活化后，變成FXa，其為凝血酶原酶的蛋白酶部分。在Arg-Ile易斷裂鍵的蛋白 酶解切割后，釋放活化肽（AP)，酶原中一系列充分確定的結(jié)構(gòu)變化驅(qū)動至成熟活性絲氨酸 蛋白酶的活化過程（參見 Toso 等人，（2008) J. Biol. Chem. 283,18627-18635 ;Bunce 等人， (2011)Blood 117,290-298 ;和 Ivanciu 等人，（2011)Nat. Biotechnol. 29,1028-1033,整體 援引加入本文）。成熟FXa具有輕鏈和含有催化結(jié)構(gòu)域的重鏈。成熟FXa在凝血酶原酶復(fù) 合物形成（其包括活化輔因子，因子Va(FVa)的結(jié)合）后變成活性絲氨酸蛋白酶。
[0028] 已開發(fā)了多種形式的FX，其在活化切割后獲得酶原樣FXa變體。即，一旦被切割， 所得到的FXa變體就具有弱活性位點功能，并且對通過循環(huán)抑制劑（即抗凝血酶III和 TFPI)的失活更有抵抗力。FXa變體因此在血漿中具有比野生型FXa更長的半衰期。FXa變 體結(jié)合FVa、脂質(zhì)膜和鈣，以形成完全活性的凝血酶原酶復(fù)合物，其有效活化凝血酶原。
[0029] 酶原樣FXa變體以酶原樣構(gòu)象循環(huán)，并且看起來不是血栓形成的（參見Toso等 人，（2008) J. Biol. Chem. 283,18627-18635 和 Ivanciu 等人，（2011)Nat. Biotechnol. 29， 1028-1033,整體援引加入本文）。此類FXa變體的例子在國際專利公開W02007/059513中 得到描述，所述國際專利公開整體援引加入本文。
[0030] 凝血酶是胰蛋白酶樣酶，其屬于具有胰凝乳蛋白酶樣折疊的蛋白酶的Sl肽酶家 族。凝血蛋白酶含有催化結(jié)構(gòu)域，其與彼此及消化的祖先絲氨酸蛋白酶是高度同源的。結(jié) 構(gòu)同源性/相同性如此之大（>70% )，使得凝血酶（包括因子Xa)的催化結(jié)構(gòu)域中的殘 基根據(jù)胰凝乳蛋白酶原中的相應(yīng)殘基進行編號。（胰凝乳蛋白酶編號系統(tǒng)；參見Bajaj和 Birktoft，Methods Enzymol. 1993;222:96-128,表 2,以及 Bode W，Mayr I，Bauman Y 等人 The refined I.9 A crystal structure of human alpha-thrombin:interaction with D-Phe-Pro-Arg chloromethylketone and significance of the Tyr-Pro-Trp insertion segment. EMBO J 1989 ;8(11) :3467-3475,所述