20mg/ml) 20 y 1、0. 2g多肽凝膠制品 及0. 04%的氨芐西林溶液（陽(yáng)性對(duì)照）20 y 1滴加在空白的藥敏片上，超凈臺(tái)內(nèi)晾干后備 用。金黃色葡萄球菌接種于LB培養(yǎng)基中，37°C擴(kuò)增培養(yǎng)12h，調(diào)菌液濃度與0. 5個(gè)麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn) 濁度相當(dāng)，再用新鮮的LB 1 : 10稀釋，取100 yL置于BHI瓊脂平板上，用滅菌的L形曲玻 棒將菌涂布均勻，將制作好的藥敏片粘貼在BHI瓊脂平板上，正置溫箱內(nèi)37°C培養(yǎng)20h，用 卡尺測(cè)量抑菌環(huán)直徑。結(jié)果如圖4所示，20mg/ml本發(fā)明制備的多肽水溶液的抑菌圈平均直 徑為18. 75_;圖5所示，陽(yáng)性對(duì)照的抑菌圈直徑為36_，本發(fā)明制備的多肽凝膠制品抑菌 圈平均直徑為26mm。以上結(jié)果表明本發(fā)明制備的林蛙皮多肽水溶液（終濃度1.82mg/ml) 及其凝膠制品（林蛙皮多肽凍干粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)1% )具有較強(qiáng)的抑菌效果。
[0036] 五、林蛙皮多肽對(duì)皮膚激光損傷修復(fù)功能實(shí)驗(yàn)
[0037] 雌性成年大鼠15只，自由采食，預(yù)飼1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。按280~350mg/kg劑量腹 腔注射10%水合氯醛進(jìn)行麻醉，備皮，2940nm鉺點(diǎn)陣激光照射大鼠背部皮膚，用無(wú)菌紗布 清理創(chuàng)口處血污。每只大鼠背部區(qū)域分組如下：A，陰性對(duì)照組，給予生理鹽水處理；B，陽(yáng)性 對(duì)照組，給予重組人表皮生長(zhǎng)因子外用溶液（EGF金因肽）處理；C，林蛙多肽處理組，其中 C1、C2和C3分別為40、20和10mg/ml濃度的本發(fā)明制備的林蛙皮多肽凝膠制品；D，酸提取 的林蛙多肽對(duì)照組，其中D1、D2和D3分別為40、20和10mg/ml濃度的酸提取林蛙皮多肽凝 膠制品。每天外涂1次，每次0.1ml。拍照記錄每日創(chuàng)面情況，硫酸坐標(biāo)紙記錄創(chuàng)面大小。 根據(jù)創(chuàng)面愈合情況，于激光照射后第6天和第9天分別處死5只大鼠，取創(chuàng)面處皮膚，福爾 馬林浸泡，石錯(cuò)包埋，切片，HE染色。
[0038] 如圖6和圖7所不，激光照射0~6天，本發(fā)明制備的林娃皮多肽和表皮生長(zhǎng)因子 處理組創(chuàng)面周圍紅腫輕，愈合速度均顯著高于陰性對(duì)照組（P < 0. 05)。其中，第3天，10mg/ ml濃度的林蛙皮多肽作用組的皮膚愈合率是陰性對(duì)照組的1. 379倍（p < 0. 001)，40mg/ml 濃度的林蛙皮多肽對(duì)皮膚的修復(fù)作用并未見顯著高于l〇mg/ml劑量組（p > 0. 05)，說(shuō)明皮 膚對(duì)林蛙皮多肽的吸收存在飽和度，l〇mg/ml濃度的林蛙皮多肽對(duì)激光損傷皮膚即具有顯 著的修復(fù)作用；此時(shí)，酸提林蛙皮多肽組創(chuàng)面周圍紅腫較嚴(yán)重。第6天（見圖8)，創(chuàng)面可見 表皮層爬行，而表皮層下出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的肉芽組織。與對(duì)照組相比，20mg/ml林蛙皮多 肽組的皮膚厚度最大，其次是40mg/ml林娃皮多肽組和EGF組，10mg/ml林娃皮多肽組與正 常皮膚厚度無(wú)明顯差別，說(shuō)明此時(shí)細(xì)胞開始啟動(dòng)自我修復(fù)能力；第9天（見圖9)，創(chuàng)面皮膚 可見結(jié)構(gòu)分明的表皮層與真皮層，林蛙皮多肽各組和EGF組傷口愈合后皮膚厚度減小，與 正常對(duì)照組無(wú)顯著差別（P > 0. 05)。其中，10mg/ml林蛙皮多肽組和陽(yáng)性對(duì)照組與正常皮膚 最為接近，說(shuō)明該濃度林蛙皮多肽即可達(dá)到理想的皮膚修復(fù)作用，且未使皮膚出現(xiàn)異常。
[0039] 六、林蛙皮多肽對(duì)皮膚HaCaT細(xì)胞增殖影響實(shí)驗(yàn)
[0040] 利用MTS檢測(cè)本發(fā)明制備的林蛙皮多肽對(duì)皮膚HaCaT細(xì)胞增殖的影響：
[0041] 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HaCaT細(xì)胞，經(jīng)0.25 %胰蛋白酶消化，用DMEM完全培養(yǎng)基制成 密度為1X 105個(gè)/ml細(xì)胞的細(xì)胞懸液，加入96孔培養(yǎng)板，每孔100 y 1，貼壁12h后，各 組培養(yǎng)孔分別加入含有〇? 4mg/ml甘氨酸（Control)或含有0、0? 1、0. 4、0. 8和1. 6mg/ml 林蛙皮多肽（EPRs)的完全培養(yǎng)基，每組6個(gè)復(fù)孔，37°C，5%C02培養(yǎng)24h。每孔加20yl CellTiter % AQueous One Solution Reagent，37°C孵育 3h，490nm 讀取吸光度值，重復(fù) 3 次。
[0042] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，如圖10所示，0. 8mg/ml和1. 6mg/ml濃度的林蛙皮多肽對(duì)HaCaT細(xì) 胞增殖均有促進(jìn)作用（P < 〇. 〇〇1)，并隨著林蛙皮多肽濃度的增大，HaCaT細(xì)胞活力逐漸增 大，說(shuō)明林蛙皮多肽對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖的影響呈劑量依賴性，該結(jié)果從細(xì)胞水平證明了本 發(fā)明制備的林蛙皮多肽對(duì)皮膚HaCaT細(xì)胞具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。
[0043] 七、林蛙皮多肽對(duì)皮膚HaCaT細(xì)胞的抗氧化作用實(shí)驗(yàn)
[0044] 本發(fā)明制備的林蛙皮多肽對(duì)皮膚HaCaT細(xì)胞的抗氧化作用檢測(cè)：
[0045] 細(xì)胞處理如實(shí)施例六所述，作用24h后取細(xì)胞培養(yǎng)上清液，12, 000r/min離心 5min，取上清，按凱基生物有限公司試劑盒說(shuō)明書方法檢測(cè)S0D、丙二醛MDA、總抗氧化能力 T-A0C、羥脯氨酸Hyp、CAT的含量變化，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，各指標(biāo)按公式計(jì)算并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分 析。
[0046] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表3)表明，多肽作用組細(xì)胞CAT、S0D、Hyp和T-A0C均比空白對(duì)照組高 (p < 0. 001)，MDA含量均比空白對(duì)照組低（P < 0. 05)。EPRQ.S作用組Hyp含量比空白對(duì)照 組升高了 2. 18倍（p <0? 01)。EPRL6作用組S0D活力比空白對(duì)照組S0D活力高出3. 6倍 (p < 0. 01)，MDA含量比空白對(duì)照組降低了 0. 4倍（p < 0. 01)。以上結(jié)果說(shuō)明林蛙皮多肽 可以減輕細(xì)胞過(guò)氧化的程度并抑制I型膠原的降解，間接證明林蛙皮多肽有修復(fù)皮膚細(xì)胞 損傷的功效。
[0047] 表3林蛙皮多肽抗氧化指標(biāo)結(jié)果
[0048]
[0049] 注："***"表示正常組與多肽作用組的各指標(biāo)比較。***p<0. 001，差異極顯著； **p < 0. 01差異極顯著；*p < 0. 05差異顯著；"一 ~ "表示EPR。.4與其他多肽作用組S0D含量 相比，'一P < 0. 001，差異極顯著；"??！ ！ "表示EPRu與其他多肽作用組T-A0C能力相比，m 口<0.001，差異極顯著；"@"表示￡?1?。.8與其他多肽作用組10^含量相比，$<0.05，差異 顯著；"#"表示EPR as與其他多肽作用組Hyp相比，@p < 0. 05,差異顯著；具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0050] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下有益效果：
[0051] 本發(fā)明不僅選擇林蛙皮多肽中的抗菌肽成分，而且將包括抑菌成分、促皮膚細(xì)胞 增殖成分、抗氧化成分等全部小分子多肽添加到凝膠中，同時(shí)輔以增稠劑、保濕劑、皮膚調(diào) 理劑、螯合劑、防腐劑、增溶劑和pH調(diào)節(jié)劑等，使得制品在具有顯著的抑菌功效的基礎(chǔ)上， 具備了更佳的創(chuàng)傷修復(fù)功效。
[0052] 本發(fā)明所述采用中性蛋白酶K酶解制備林蛙皮多肽，使之在人體皮膚適宜的pH值 5. 5~7. 5范圍內(nèi)的溶解度大大提高，避免了對(duì)皮膚的刺激；而且，本發(fā)明將林蛙皮多肽酶 解為2000Da以下的小分子，更有利于人體皮膚吸收。
[0053] 顯而易見，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明制備的林蛙皮多肽修復(fù)凝膠具備理想的抑菌 效果和創(chuàng)傷修復(fù)能力，并有效地避免了皮膚刺激性，能夠快速、有效、安全地促進(jìn)人體皮膚 創(chuàng)傷愈合；而且，本發(fā)明采用的原料來(lái)自于林蛙油的加工副產(chǎn)物，保護(hù)環(huán)境的同時(shí)有效利用 了副產(chǎn)物，提高了林蛙油加工原料的利用率，降低了成本，其制備方法工藝成熟，操作簡(jiǎn)單， 有利于工業(yè)化批量生產(chǎn)，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【附圖說(shuō)明】
[0054] 圖1是標(biāo)準(zhǔn)品的高效凝膠過(guò)濾色譜圖；
[0055]圖2是林蛙皮多肽的高效凝膠過(guò)濾色譜圖；
[0056] 圖3是林蛙皮多肽的紅外光譜圖；
[0057] 圖4是林蛙皮多肽對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈圖；
[0058]圖5是含有林蛙皮多肽的微創(chuàng)修復(fù)凝膠對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈圖；
[0059]圖6是林蛙皮多肽對(duì)大鼠皮膚激光損傷的修復(fù)圖；
[0060]圖7是中林蛙皮多肽對(duì)大鼠皮膚激光損傷創(chuàng)面愈合率的影響圖；
[0061] 圖8是林蛙皮多肽對(duì)大鼠皮膚激光損傷后第6天各組皮膚HE染色圖；
[0062] 圖9是林蛙皮多肽對(duì)大鼠皮膚激光損傷后第9天各組皮膚HE染色圖；
[0063] 圖10是林蛙皮多肽促進(jìn)HaCaT細(xì)胞增殖的MTS結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0064] 下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述，但這些實(shí)施例僅用于解釋本發(fā)明，對(duì) 本發(fā)明的范圍并不構(gòu)成任何限制。
[0065] 實(shí)施例1
[0066] (1)將鮮剝?nèi)∮秃罅滞軞報(bào)w洗凈后扒皮，取1000g林蛙皮，用膠體磨將林蛙皮絞 碎，加入5000ml蒸餾水制成勻漿，加入10g酶活力為100000U/g的中性蛋白酶K，在55°C酶 解4h后，先用100~1000目濾布過(guò)濾，依次通過(guò)截留分子量為100kDa的超濾膜和截留分 子量為10kDa的超濾膜過(guò)濾