，再通過(guò)截留分子量為300Da的納濾膜過(guò)濾，利用220nm波長(zhǎng)處 的吸光度值監(jiān)測(cè)截留液中的多肽濃度（12~20mg/ml)，當(dāng)多肽濃度為18. 33mg/ml時(shí)，得到 1200ml截留液，向截留液中加入48g甘氨酸，凍干后制得林蛙皮多肽凍干粉70g。林蛙皮凍 干粉中多肽含量為 31. 43% [(70g-48g)/70g]，多肽提取率為 2. 2% [(70g-48g)/1000g]。
[0067] (2)室溫下，將6. 5g C10-30烷醇丙烯酸酯交聯(lián)聚合物慢慢散入300ml蒸餾水中， 浸泡20min待其全部下沉后攪拌升溫至80°C，依次加入568. 4ml蒸餾水、20g海藻糖、0. 5g 乙二胺四乙酸二鈉，混合均勻；再加入由30ml甘油和lg羧甲基葡聚糖鈉制成的混合 液，先攪拌加熱至80°C，再攪拌降溫至45°C;
[0068](3)將30ml丁二醇、7g1，2-己二醇、2. 5ml苯氧乙醇、1. 5mlPEG-40氫化蓖麻油 預(yù)先混合溶解，加熱至40°C后加入到第（2)步中已降溫至45°C的混合液中，攪拌均勻，用 10mg/ml的氫氧化鉀水溶液調(diào)節(jié)其pH值為5. 5 ;
[0069] (4)將0. 4g透明質(zhì)酸鈉慢慢散入40ml蒸餾水中，待其全部溶解后，再加入10g水 解蜂王漿蛋白、2. 6g棕櫚酰三肽-5和10g林蛙皮多肽凍干粉，配制成混合液，再將此混合液 加入到第（3)步中準(zhǔn)備的混合液中，攪拌均勻后降溫至38°C，即得含有林蛙皮多肽的微創(chuàng) 修復(fù)凝膠l〇30g。
[0070] 實(shí)施例2
[0071] (1)將鮮剝?nèi)∮秃罅滞軞報(bào)w洗凈后扒皮，取500g林蛙皮，用膠體磨將林蛙皮絞碎， 加入3750ml蒸餾水制成勻漿，加入5g酶活力為100000U/g的中性蛋白酶K，在60°C酶解3h 后，先用100~1000目濾布過(guò)濾依次通過(guò)截留分子量為100kDa的超濾膜和截留分子量為 10kDa的超濾膜過(guò)濾，再通過(guò)截留分子量為300Da的納濾膜過(guò)濾，利用220nm波長(zhǎng)處的吸光 度值監(jiān)測(cè)截留液中的多肽濃度（12~20mg/ml)，當(dāng)多肽濃度為14. 17mg/ml時(shí)，得到1200ml 截留液，向截留液中加入48g甘氨酸，凍干后制得林蛙皮多肽凍干粉65g。林蛙皮凍干粉中 多肽含量為 26. 15% [(65g-48g)/65g]，多肽提取率為 3.4% [(65g-48g)/500g];
[0072] (2)室溫下，將4. 55g C10-30烷醇丙烯酸酯交聯(lián)聚合物慢慢散入210ml蒸餾水 中，浸泡30min待其全部下沉后攪拌升溫至90°C，依次加入397. 88ml蒸餾水、14g海藻糖、 0. 35g乙二胺四乙酸二鈉，混合均勻；再加入由21ml甘油和0. 7g羧甲基0 -葡聚糖鈉制成 的混合液，先攪拌加熱至90°C，再攪拌溶解降溫至45°C ;
[0073] (3)將 21ml 丁二醇、4. 9g 1，2-己二醇、1. 75ml 苯氧乙醇、1. 05ml PEG-40 氫化蓖 麻油預(yù)先混合溶解，加熱至42°C后加入到第（2)步中已降溫至45°C的混合液中，攪拌均勻， 用10mg/ml的氫氧化鉀水溶液調(diào)節(jié)其pH值為6. 5 ;
[0074] (4)將0. 28g透明質(zhì)酸鈉慢慢散入28ml蒸餾水中，待其全部溶解后，再加入7g水 解蜂王漿蛋白、1. 82g棕櫚酰三肽-5和7g林蛙皮多肽凍干粉，配制成混合液，再將此混合液 加入到第（3)步中準(zhǔn)備的混合液中，攪拌均勻后降溫至38°C，即得含有林蛙皮多肽的微創(chuàng) 修復(fù)凝膠721g。
[0075] 實(shí)施例3
[0076] (1)將鮮剝?nèi)∮秃罅滞軞報(bào)w洗凈后扒皮，取250g林蛙皮，用膠體磨將林蛙皮絞碎， 加入2500ml蒸餾水制成勻漿，加入2. 5g酶活力為100000U/g的中性蛋白酶K，在65°C酶 解2h后，先用100~1000目濾布過(guò)濾，依次通過(guò)截留分子量為100kDa的超濾膜和截留分 子量為10kDa的超濾膜過(guò)濾，再通過(guò)截留分子量為300Da的納濾膜過(guò)濾，利用220nm波長(zhǎng)處 的吸光度值監(jiān)測(cè)截留液中的多肽濃度（12~20mg/ml)，當(dāng)多肽濃度為12. 00mg/ml時(shí)，得到 500ml截留液，向截留液中加入20g甘氨酸，凍干后制得林蛙皮多肽凍干粉26g。林蛙皮凍 干粉中多肽含量為 23.08% [(26g-20g)/26g]，多肽提取率為 2.4% [(26g-20g)/250g];
[0077] (2)室溫下，將1. 95g C10-30烷醇丙烯酸酯交聯(lián)聚合物慢慢散入90ml蒸餾水中， 浸泡25min待其全部下沉后攪拌升溫至85°C，依次加入170. 52ml蒸餾水、6g海藻糖、0. 15g 乙二胺四乙酸二鈉，混合均勻；再加入由9ml甘油和0. 3g羧甲基0 -葡聚糖鈉制成的混合 液，先攪拌加熱至85°C，再攪拌溶解降溫至45°C ;
[0078] (3)將 9. 0ml 丁二醇、2. lg 1，2 己二醇、0? 75ml 苯氧乙醇、0? 45ml PEG-40 氫化蓖 麻油預(yù)先混合溶解后，加熱至45°C后加入到第（2)步中已降溫至45°C的混合液中，攪拌均 勻，用lOmg/ml的氫氧化鉀水溶液調(diào)節(jié)其pH值為7. 5 ;
[0079] (4)將0. 12g透明質(zhì)酸鈉慢慢散入12ml蒸餾水中，待其全部溶解后，再加入3g水 解蜂王漿蛋白、0. 78g棕櫚酰三肽-5和3g林蛙皮多肽凍干粉，配制成混合液，再將此混合液 加入到第（3)步中準(zhǔn)備的混合液中，攪拌均勻后降溫至38°C，即得含有林蛙皮多肽的微創(chuàng) 修復(fù)凝膠309g。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種含有林娃皮多肽的微創(chuàng)修復(fù)凝膠，其特征在于，含有如下質(zhì)量份的組分：100份 林蛙皮多肽凍干粉，65份C10-30烷醇丙烯酸酯交聯(lián)聚合物，200份海藻糖，5份乙二胺四乙 酸二鈉，300份甘油，10份羧甲基P -葡聚糖鈉，300份丁二醇，70份1，2-己二醇，25份苯氧 乙醇，15份PEG-40氫化蓖麻油，100份水解蜂王漿蛋白，26份棕櫚酰三肽-5和4份透明質(zhì) 酸鈉。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種含有林蛙皮多肽的微創(chuàng)修復(fù)凝膠的制備方法，其特征在 于，按照權(quán)利要求1所述的各組分質(zhì)量份數(shù)，包括如下步驟： (1) 將鮮剝?nèi)∮秃蟮牧滞軞報(bào)w洗凈后扒皮，用膠體磨將林蛙皮絞碎，加入林蛙皮質(zhì)量 5~10倍的蒸餾水制成勻漿，加入林蛙皮質(zhì)量1 %的中性蛋白酶K，在55~65°C酶解2~ 4h后，先用100~1000目濾布過(guò)濾，依次通過(guò)截留分子量為IOOkDa的超濾膜和截留分子量 為IOkDa的超濾膜過(guò)濾，再通過(guò)截留分子量為300Da的納濾膜過(guò)濾，取截留液，向截留液中 加入截留液質(zhì)量4%的甘氨酸，凍干后制得林蛙皮多肽凍干粉； (2) 室溫下，將C10-30烷醇丙烯酸酯交聯(lián)聚合物慢慢散入3000份蒸餾水中，浸泡20~ 30min待其全部下沉后，攪拌升溫至80~90°C，再加入5680份蒸餾水后，依次加入海藻糖、 乙二胺四乙酸二鈉，混合均勻；此時(shí)加入由甘油和羧甲基P -葡聚糖鈉制成的混合液，攪拌 加熱至80~90°C，然后攪拌降溫至45°C ; (3) 將丁二醇、1. 2-己二醇、苯氧乙醇、PEG-40氫化蓖麻油混合后，加熱至40~45°C， 加入到步驟（2)中已降溫至45°C的混合液中，攪拌均勻，用lOmg/ml氫氧化鉀水溶液調(diào)節(jié)混 合液的pH值為5. 5~7. 5 ; (4) 將透明質(zhì)酸鈉慢慢散入400份蒸餾水中，待其全部溶解后，再加入水解蜂王漿蛋 白、棕櫚酰三肽-5和林蛙皮多肽凍干粉，配制成混合液，再將此混合液加入到步驟（3)中制 備的混合液中，攪拌均勻后降溫至38°C，即得含有林蛙皮多肽的微創(chuàng)修復(fù)凝膠。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種含有林蛙皮多肽的微創(chuàng)修復(fù)凝膠的制備方法，其特征在 于，所述中性蛋白酶K的酶活力為100000U/g。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種含有林蛙皮多肽的微創(chuàng)修復(fù)凝膠，含有如下質(zhì)量份的組分：100份林蛙皮多肽，65份丙烯酸(酯)類/C10-30烷醇丙烯酸酯交聯(lián)聚合物，200份海藻糖，5份乙二胺四乙酸二鈉，300份甘油，10份羧甲基β-葡聚糖鈉，300份丁二醇，70份1,2-己二醇，25份苯氧乙醇，15份PEG-40氫化蓖麻油，100份水解蜂王漿蛋白，26份棕櫚酰三肽-5和4份透明質(zhì)酸鈉。本發(fā)明采用林蛙皮多肽為主要成分，輔以增稠劑、保濕劑、皮膚調(diào)理劑、螯合劑和增溶劑等，制成具有抑菌和創(chuàng)傷修復(fù)功效的凝膠。本發(fā)明中性蛋白酶K酶解方法制備林蛙皮多肽，使多肽分子量低于2000Da，更有利于人體皮膚吸收；同時(shí)本發(fā)明制備的凝膠成品pH值為5.5～7.5，避免了對(duì)皮膚的刺激性。
【IPC分類】A61K35/65, C12P21/06, C07K1/34, A61K9/06, A61K38/02, A61P31/04, A61P17/00
【公開號(hào)】CN105012933
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510506933
【發(fā)明人】郝林琳, 李思明, 張寶元, 鄧旭明, 張梅, 丁克祥, 于浩, 劉松財(cái)
【申請(qǐng)人】吉林大學(xué)
【公開日】2015年11月4日
【申請(qǐng)日】2015年8月18日