抗分泌因子(af)在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤治療中的用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及抗分泌因子（AF)蛋白，具有等效的功能活性的其肽、其衍生物、其同 系物和/或其片段，和/或其藥學(xué)活性鹽作為佐劑用于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤治療和/或用于優(yōu) 化至膠質(zhì)母細(xì)胞瘤腫瘤細(xì)胞的藥物物質(zhì)和/或制劑諸如抗癌藥的遞送和細(xì)胞攝取、免疫治 療、放射治療或者基因遞送的用途。
[0002] 在另一方面，本發(fā)明涉及監(jiān)測和/或驗(yàn)證和/或增強(qiáng)患有膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的患者中 的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的治療控制的新型且可靠的診斷和/或預(yù)后工具的設(shè)計(jì)。
【背景技術(shù)】
[0003] 多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM)是最常見的和最有攻擊性的人類原發(fā)性腦腫瘤，其涉 及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞并占據(jù)全部顱內(nèi)腫瘤的大部分。多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是原發(fā)性腦腫瘤的約 120種不同類型中最流行的瘤形式。在歐洲和北美，GBM年發(fā)病率是每100000人2-3例病 例。根據(jù)WHO的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的腫瘤分類，該腦腫瘤的標(biāo)準(zhǔn)名稱是"膠質(zhì)母細(xì)胞瘤〃，并且 其以若干種變型存在。
[0004] 多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM)被認(rèn)為是最常見和致死形式的中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌。當(dāng)前 使用的手術(shù)方法、化療劑、免疫療法和放療策略在延長被診斷患有GBM的患者的預(yù)期壽命 方面幾乎沒有作為。治療該惡性疾病的難度在于其內(nèi)在復(fù)雜性和其復(fù)雜的耐藥性機(jī)制。
[0005] 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤具有任何中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS)惡性腫瘤的最差預(yù)后，盡管多模式治 療由手術(shù)切除盡可能多的腫瘤，及同時(shí)或依序化療、放療、抗血管生成療法、免疫療法、伽瑪 刀放射手術(shù)及使用皮質(zhì)類固醇的癥狀治療組成。預(yù)后極差，其中中位存活時(shí)間為大約一年， 并且所述疾病幾乎總是致命的，因?yàn)閮H約3%存活超過3年。
[0006] 多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤腫瘤，也被稱為IV級，特征在于存在由具有多次有絲分裂和 內(nèi)皮增殖的間變性細(xì)胞圍繞的壞死性組織區(qū)域。該特征以及存在增生性異常血管使腫瘤與 不具有這些特征的III級星形細(xì)胞瘤區(qū)分開來。
[0007] 存在數(shù)種膠質(zhì)母細(xì)胞瘤亞型。在'典型'亞型中97%的腫瘤攜帶表皮生長因子受 體（EGFR)基因的額外拷貝，并且大部分具有比正常EGFR表達(dá)更高的表達(dá)，而經(jīng)常在膠質(zhì)母 細(xì)胞瘤中突變的基因TP53很少在該亞型中突變。相反，原神經(jīng)亞型通常具有高的TP53和 TOGFRa (編碼a型血小板源性生長因子受體的基因）及IDHI(編碼異檸檬酸脫氫酶-1的 基因）的變化率。間充質(zhì)亞型的特征在于NF1 (編碼1型神經(jīng)纖維瘤病的基因）的高突變 率或其它變化，EGFR基因的較少變化及EGFR而非其它類型的較少表達(dá)。
[0008] GBM腫瘤通常在腦白質(zhì)中存在，生長快速并可在引起癥狀之前變得非常大。在低級 星形細(xì)胞瘤或間變性星形細(xì)胞瘤的去分化之后，少于10%更慢地形成。這些被稱為繼發(fā)性 GBM腫瘤并且在更年輕的患者（平均年齡45對比62歲）中更常見。腫瘤可延伸至腦膜或 心室壁內(nèi)，從而在腦脊髓液（CSF)中產(chǎn)生高蛋白含量（>100mg/dL)，以及10至100個(gè)細(xì)胞 的偶爾腦脊液細(xì)胞增多，大多數(shù)是淋巴細(xì)胞。CSF中載有的惡性細(xì)胞可擴(kuò)散（很少地）至 脊髓或引起腦膜膠質(zhì)瘤病。然而，GBM轉(zhuǎn)移超出中樞神經(jīng)系統(tǒng)是極其不尋常的。約50%的 GBM腫瘤占據(jù)半球的多于一個(gè)葉或是雙側(cè)的。該類型的腫瘤通常源于大腦并且可能很少呈 現(xiàn)在胼胝體上的典型浸潤，從而產(chǎn)生蝴蝶狀（雙側(cè)）神經(jīng)膠質(zhì)瘤。
[0009] 所述腫瘤可呈現(xiàn)多種外觀，這取決于出血的量、壞死和/或其年齡。CT掃描通常將 顯示具有低密度中心和由水腫圍繞的強(qiáng)化的可變環(huán)的不均勻腫塊。腫瘤和水腫的占位效應(yīng) 可壓縮雙室并引起如腦積水以及機(jī)械形變和疝形成。
[0010] 異常的、功能失調(diào)性的腫瘤維管結(jié)構(gòu)和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞（GSC)的形成 據(jù)信是不能有效治療GBM腫瘤的主要因素。此外，將腫瘤細(xì)胞緊緊包在保護(hù)性糖萼包衣中， 從而預(yù)防如藥物的接近以達(dá)到腫瘤細(xì)胞并在其上發(fā)揮作用。
[0011] 原發(fā)性腦腫瘤和腦轉(zhuǎn)移的治療由根治性、癥狀性和姑息性療法組成。
[0012] 用于癥狀療法的原發(fā)性支持劑是抗驚厥藥和皮質(zhì)類固醇。
[0013] 根治性和姑息性治療包括手術(shù)、放射治療、免疫治療和化療。最大限度可行的切除 術(shù)通常連同放射和化療進(jìn)行。腫瘤的全切除（Gross total resection)與更佳的預(yù)后相關(guān)。
[0014] 遺憾地是，GBM腫瘤已知含有表現(xiàn)出缺氧的組織的區(qū)域，所述區(qū)域?qū)Ψ暖煾叨饶?受。腫瘤干細(xì)胞已被證實(shí)占優(yōu)勢并對可用的療法耐受。迄今為止，成功尋求到化療、免疫治 療和放射致敏劑的各種方法是有限的。
[0015] 此外，在其它治療中，當(dāng)前還測試了基因轉(zhuǎn)移和蛋白治療性治療。
[0016] 在無任何治療的情況下，從診斷時(shí)間起的中位存活時(shí)間是3個(gè)月，而在完全自理 的情況下，如今天所用，約1年。在現(xiàn)代、大量的治療之后的2年，僅五分之一存活。年齡增 長（>60歲）帶有更差的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)。死亡通常由于腦水腫和/或增加的顱內(nèi)壓所致，并且另 外由于損傷血液循環(huán)和引起腦疝形成的占位效應(yīng)所致。
[0017] 因此存在對改進(jìn)的和/或優(yōu)化的GBM腫瘤治療的長久需要。
[0018] 抗分泌因子（AF)是起初被描述為提供抗腹瀉病和腸炎保護(hù)的41kDa蛋白（關(guān)于 綜述，參見Lange和Ulfflrotll，2001)?？狗置谝蜃樱ˋF)蛋白已被測序并且其cDNA被克隆。 抗分泌活性似乎主要由位于抗分泌因子（AF)蛋白序列上的氨基酸位置35與50之間且包 含共有序列的至少4-16個(gè)諸如4、6、7、8或16個(gè)氨基酸的肽施加。免疫化學(xué)和免疫組織化 學(xué)調(diào)查已揭示抗分泌因子（AF)蛋白存在并且還可由體內(nèi)的大部分組織和器官合成。包含 止瀉序列的合成肽先前已被描述（W0 97/08202 ;W0 05/030246)?？狗置谝蜃樱ˋF)蛋白和 肽之前已被公開可在用霍亂毒素激發(fā)之后使病理性流體運(yùn)輸和/或炎癥反應(yīng)正常化，諸如 在腸中和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的脈絡(luò)叢中（W0 97/08202)。能夠誘導(dǎo)AF的內(nèi)源性合成或添加的 AF的攝取的食物和飼料因此已表明可用于治療W0 97/08202中的水腫、腹瀉、脫水和炎癥。 TO 98/21978公開了使用具有酶活性的產(chǎn)物以生產(chǎn)具有誘導(dǎo)抗分泌因子（AF)蛋白形成的 食物。W0 00/038535另外公開了富含天然的像這樣的抗分泌因子（AF)蛋白的食品。
[0019] 抗分泌因子（AF)蛋白及其片段還顯示出在與細(xì)胞損失和/或增加相關(guān)的疾患的 治療中可改善神經(jīng)組織的修復(fù)及干細(xì)胞和祖細(xì)胞及其衍生的細(xì)胞的增殖、凋亡、分化和/ 或迀移（W0 05/030246)，并且在治療和/或預(yù)防眼內(nèi)高血壓（W007/126364)與治療和/或 預(yù)防間室綜合征（W0 07/126363)同樣有效。
[0020] 此外，本發(fā)明人最近指出AF能夠監(jiān)測和/或有利地影響膜中的脂筏、受體和/或 胞膜窖的結(jié)構(gòu)、分布和多種功能，并因此可用于治療和/或預(yù)防細(xì)胞膜中的脂筏和/或胞膜 窖的結(jié)構(gòu)混亂和功能障礙（W0 07/126365)。
[0021] 本發(fā)明人此外能夠證明相同的抗分泌因子（AF)蛋白、其肽及其片段可干預(yù)跨膜 蛋白的生物活化，如NKCC1通過FAK和CAP，并且它們因此可直接調(diào)控病理細(xì)胞和/或擾 動細(xì)胞中的離子通道的病理活性，從而有效地使所述細(xì)胞中的胞內(nèi)壓和跨膜蛋白功能正常 化，并因此使得如癌癥療法所用的藥物攝取改善（W0 2010/093324)。
[0022] 本申請首次公開抗分泌因子（AF)蛋白、其肽、其同系物和/或其片段可另外用于 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的癥狀性、根治性和姑息性療法中。特別地，它們可在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的治療中 用作佐劑和/或用于優(yōu)化藥物和基因遞送以及化療、免疫治療和放療。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0023] 本申請首次公開對治療GBM腫瘤的有效方法的長期探索。其令人驚訝地公開了抗 分泌因子AF可用于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的癥狀性、根治性和姑息性療法中。特別地，其可在膠質(zhì) 母細(xì)胞瘤的治療中用作佐劑和/或用于優(yōu)化藥物和基因遞送、以及化療、免疫治療和放療。
[0024] 如在實(shí)驗(yàn)章節(jié)中所示，本申請首次公開了具有等效活性并包含如SEQID N0:2(AF-6)所示的氨基酸序列的如SEQIDN0:1(AF)所示的抗分泌因子（AF)蛋白的片段， 其用于降低由膠質(zhì)母細(xì)胞瘤腫瘤所引起的升高的顱內(nèi)壓至約20mmHg或更低的可接受的水 平以及用于促進(jìn)和/或改善化療物質(zhì)進(jìn)入膠質(zhì)母細(xì)胞瘤腫瘤細(xì)胞中。
[0025] 本發(fā)明因此涉及用于治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM腫瘤）的如SEQIDN0:1(AF)所示 的抗分泌因子（AF)蛋白，和/或具有等效活性并至少包含如SEQIDN0:2(AF-6)所示的氨 基酸序列的其同系物和/或其片段，和/或其藥學(xué)活性鹽。在一個(gè)實(shí)施方式中，其涉及用于 治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM腫瘤）的富含所述抗分泌因子（AF)蛋白和/或其同系物和/或其 片段的食物和/或食物補(bǔ)充劑。
[0026] 如本文所定義的抗分泌因子（AF)蛋白和/或其同系物和/或其片段和/或其藥 學(xué)活性鹽，和/或富含所述抗分泌因子（AF)蛋白和/或其同系物和/或其片段的食物和/ 或食物補(bǔ)充劑，可用于制造用于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的癥狀性、根治性和/或姑息性療法的組合 物和/或用在癥狀性、根治性和/或姑息性治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的方法中。
[0027] 特別地，抗分泌因子（AF)蛋白和/或其同系物和/或其片段和/或其藥學(xué)活性鹽， 和/或富含所述抗分泌因子（AF)蛋白和/或其同系物和/或其片段的食物和/或食物補(bǔ) 充劑可用于優(yōu)化治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM腫瘤）所用的另外的藥物物質(zhì)和/或制劑的遞送 和/或細(xì)胞攝取和/或基因遞送。另一方面，抗分泌因子（AF)蛋白和/或其同系物和/或 其片段和/或其藥學(xué)活性鹽，和/或富含所述抗分泌因子（AF)蛋白和/或其同系物和/或 其片段的食物和/或食物補(bǔ)充劑本身可用作膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM腫瘤）治療中的藥物。
【附圖說明】
[0028]圖1 :
[0029] 在中心具有RG2-N32膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（深色染色；第22天）的大鼠腦的橫截面，由 水腫腦組織（淺橙色）界定。注意圖片中心的右半球是放大的，導(dǎo)致中線偏移以及位錯(cuò)及 中線和側(cè)腦室的變形。
[0030]圖 2:
[0031] 圖1的更高放大倍數(shù)。高度細(xì)胞腫瘤通過指樣伸展侵入腦組織，使得腫瘤難于界 定。
[0032]圖 3:
[0033] RG2-N32膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的熒光顯微圖片經(jīng)處理用于說明糖萼，其對每個(gè)腫瘤細(xì)胞 界定。每個(gè)腫瘤細(xì)胞由富含a-N-乙酰半乳糖胺（綠色/由白色箭頭標(biāo)記）的糖萼以及在 較小程度上由a-N-乙酰葡糖胺（紅色）包圍。注意紅細(xì)胞的紅色染色。將兩個(gè)大血管用 黑色箭頭標(biāo)記。
[0034]圖 4:
[0035] 經(jīng)麻醉的大鼠倚靠在其腹部。暴露頭骨，且用于兩個(gè)Samba壓力傳感器的光導(dǎo)件 通過顱中的孔洞進(jìn)入腦中。將所述兩個(gè)光導(dǎo)件（箭頭）在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)通過支撐儀器固定， 但在這張照片中不含所述支撐儀器以便于說明。
[0036]圖 5:
[0037] 在具有膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的大鼠（第22天）的半小時(shí)記錄期間，升高的顱內(nèi)壓顯現(xiàn)為 大約30mmHg。正常大鼠中相應(yīng)的壓力為5. 3±2.1mmHg。擴(kuò)展的腫瘤團(tuán)塊和腦水腫均造 成壓力升高。
[0038]圖 6:
[0039] 具有膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的大鼠中的顱內(nèi)壓將隨著時(shí)間增加，并最終引起擴(kuò)大的腦變形 和位錯(cuò)以及疝形成和循環(huán)衰竭。當(dāng)前幾乎沒有任何選擇可用于能夠?qū)游飶哪[瘤擴(kuò)大和腦 水腫引起的有害效應(yīng)中拯救出來。將所述動物在由箭頭指示的時(shí)間處死。
[0040]圖 7:
[0041] 具有膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的大鼠中的顱內(nèi)壓從經(jīng)鼻施用AF-16 (4mg/kg bw)后約12分鐘 開始降低。紅線和藍(lán)線顯示壓力降低同時(shí)在任一個(gè)腦半球中進(jìn)行，在半個(gè)小時(shí)內(nèi)實(shí)現(xiàn)壓力 為約20mmHg，其被認(rèn)為是可接受的水平。
[0042]圖 8:
[0043] 具有膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的大鼠中的顱內(nèi)壓從經(jīng)鼻滴注AF-6(lmg/kgbw)之后約15分 鐘開始降低。在幾乎半個(gè)小時(shí)后獲得17.7mmHg。
[0044]圖9和圖10:
[0045] 向在它們的右腦半球具有膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的大鼠在靜脈內(nèi)注射示蹤劑多柔比星 (10mg/kg bw)之前1小時(shí)經(jīng)鼻滴注媒介物、水（圖9)或AF-16(4mg/kg bw)。30分鐘后從 經(jīng)麻醉的動物移除腦，并對其進(jìn)行處理用于熒光顯微術(shù)。與在用媒介物預(yù)處理之后獲得的 結(jié)果相