酸序列共價(jià)連接形成，其直接或通過短或長的接頭部分，通過治療 性proteinacious成分上的一個(gè)或多個(gè)官能團(tuán)例如胺基、羧基、苯基、疏基或羥基形成共價(jià) 綴合物?？梢允褂枚喾N常見的接頭，例如二異氰酸酯、二異硫氰酸酯、碳二亞胺、二（羥基琥 珀酰亞胺）酯、馬來酰亞胺-羥基琥珀酰亞胺酯、戊二醛等。
[0167] 此外，非肽化學(xué)間隔可以是任意適宜的類型，包括例如生物綴合技術(shù)，Greg T.Hermanson，Academic Press, Inc.出版，1995中所描述的功能接頭，和交聯(lián)試劑技術(shù)手 冊，Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, Illinois)中所提及的那些，其全部內(nèi)容均通 過全文引用并入本申請。示例性的化學(xué)間隔包括同雙功能接頭，其能夠與Lys的胺基連接， 以及異雙功能接頭連接，所述的異雙功能接頭能夠在一個(gè)末端與Cys連接和在另一個(gè)末端 與Lys連接。
[0168] 在某些實(shí)施方式中，將在室溫下（或人體體溫，例如Tt>37°C )不轉(zhuǎn)變的相對較小 的ELP成分（例如小于約30kDa、25kDa、20kDa、15kDa或10kDa的ELP成分）化學(xué)偶聯(lián)或交 聯(lián)。例如，可以將兩個(gè)具有相同或不同性質(zhì)的相對小的ELP成分化學(xué)偶聯(lián)。在一些實(shí)施方 式中，此類偶聯(lián)可以發(fā)生在體內(nèi)，通過在ELP的C-末端上或其周圍加入單一的半胱氨酸殘 基。此類ELP成分可以分別與一個(gè)或多個(gè)胰島素氨基酸序列融合，以便在靶點(diǎn)增加活性或 親合性。
[0169] 治療疾病的方法
[0170] 在不同實(shí)施方式中，所述治療提供持續(xù)的血糖控制。血糖控制指在糖尿病患者中 典型的血糖（葡萄糖）水平。多種糖尿病的長期并發(fā)癥，包括微血管并發(fā)癥是由于多年的 高血糖導(dǎo)致的。良好的血糖控制是糖尿病護(hù)理的重要目標(biāo)。由于血糖水平在一天中是波動 的并且葡萄糖記錄并不是這些改變的完美指示，因此在糖尿病患者的研究試驗(yàn)和臨床護(hù)理 中使用用于糖基化的血紅蛋白的百分率作為長期血糖控制的替代指標(biāo)。在這項(xiàng)檢測中，血 紅蛋白Ale或糖化血紅蛋白（HbAlc)反映了之前2-3個(gè)月的平均葡萄糖值。
[0171] 通過最常用的方法在具有正常的葡萄糖代謝的非糖尿病人群中，糖化血紅蛋白水 平通常為約4-6% (正常范圍可能隨著方法而改變）。"完美的血糖控制"指葡萄糖水平一 直是正常的（例如約70 - 130mg/dl，或者約3. 9-7. 2mmol/L)并且不能區(qū)別非糖尿病人群。 事實(shí)上，由于治療措施是不完美的，即使"好的血糖控制"所描述的血糖水平在大多數(shù)時(shí)間 里也是平均略高于正常水平的。值得注意的是所認(rèn)為的"好的血糖控制"隨著年齡和患者對 低血糖的敏感性而改變。美國糖尿病協(xié)會建議患者和醫(yī)師要努力將平均葡萄糖和血紅蛋白 Ale值控制在低于200mg/dl (llmmol/1)和8%。"差的血糖控制"指持續(xù)升高的血糖和糖化 血紅蛋白水平，其可能在嚴(yán)重并發(fā)癥出現(xiàn)前的數(shù)月和數(shù)年間在例如約200 - 500mg/dl (約 ll-28mmol/L)和約9-15%或更高的范圍內(nèi)。
[0172] 在不同實(shí)施方式中，本申請所述的本發(fā)明的藥物組合物用于管理和護(hù)理患有疾病 如糖尿病或高血糖或者任意其他狀況的患者，對于這些患者胰島素的施用適用于抗擊或減 輕這些狀況的癥狀和并發(fā)癥，其包括多種代謝病癥。治療包括施用本發(fā)明的藥劑、組合物或 制劑以阻止所述癥狀或并發(fā)癥的起始、減輕所述癥狀或并發(fā)癥，或者消除所述疾病、狀況或 病癥。本方法包括治療1型糖尿病，即機(jī)體不產(chǎn)生胰島素并且因此不能控制血液中糖的量 的狀況，和2型糖尿病，即機(jī)體不能正確地使用胰島素并其因此不能控制血液中糖的量的 狀況。在一些實(shí)施方式中，患者患有一種或多種糖尿病并發(fā)癥，包括心血管并發(fā)癥，或者在 一些實(shí)施方式中患有代謝疾病和/或具有臨床肥胖癥或超重的特征。在一些實(shí)施方式中， 患者（在治療方案開始時(shí)）的HbAlc高于約12%、高于約10%、高于約9%、或高于約8. 5、 或高于約8%、或高于約7. 5%、或高于約7. 0、或高于約6. 5。
[0173] 由于所述活性劑消除或降低與IGF受體的相互作用，在一些實(shí)施方式中，本申請 所述的活性劑特別適于長期療法，包括進(jìn)行多年的治療（例如至少約2年、至少約3年、至 少約5年、至少約10年或者更長時(shí)間）。
[0174] 在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了施用基礎(chǔ)胰島素和餐時(shí)胰島素聯(lián)合療法的方 法，其可以單獨(dú)或一起施用。例如，在一些實(shí)施方式中，患者接受速效和/或長效胰島素方 案，其中至少一種此類藥劑具有提供使多聚體形成喪失或持續(xù)釋放的融合伴侶。在一些實(shí) 施方式中，提供降低多聚體形成的速效胰島素與甘精胰島素或地特胰島素作為共同療法。 其是指如所描述的向患者施用所述速效胰島素融合，其中所述患者正在使用甘精胰島素或 地特胰島素的基礎(chǔ)胰島素療法。在其他實(shí)施方式中，將提供持續(xù)釋放的長效胰島素與賴脯 胰島素、天冬胰島素或賴谷胰島素中的一種或多種作為共同療法。其是指如所描述的向患 者施用所述長效胰島素融合，其中所述患者正在使用具有賴脯胰島素、天冬胰島素或賴谷 胰島素的餐時(shí)胰島素療法。
[0175] 在不同實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了聯(lián)合療法和/或共制劑，其包含本申請所述的 藥物組合物和有效治療疾病的其他藥劑，例如如上文所述的那些。
[0176] 在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了（持續(xù)釋放胰島素或餐時(shí)胰島素）與胰高血糖 素樣受體（GLP) -1受體激動劑，如GLP-1 (SEQ IDN0:30)、艾塞那肽-4 (SEQ IDN0:31)，或 如美國專利8, 178, 495中所公開的其功能性類似物或其衍生物的聯(lián)用或共制劑，其通過引 用并入本申請。在一些實(shí)施方式中，所述GLP-1是GLP-1 (A-B)，其中A是1至7的整數(shù)和B 是38至45的整數(shù)。在一些實(shí)施方式中，所述GLP-1是GLP-1 (7-36)，或其功能性類似物，或 者GLP-1 (7-37)或其功能性類似物。在一些實(shí)施方式中，所述GLP-1受體激動劑包含還允 許持續(xù)釋放的融合伴侶，例如具有US 2013/0090285中公開的PK性質(zhì)，其通過引用并入本 申請。因此，所述GLP-1受體激動劑可以具有SEQ ID N0:32所示的序列。在一些實(shí)施方式 中，所述GLP-1受體激動劑融合伴侶是ELP1-120,其中所述客體殘基是比例約為5:2:3的纈 氨酸、丙氨酸和甘氨酸。如圖37至41所示，此類共制劑提供了協(xié)同作用，并且能夠降低所 施用的這兩種藥劑的劑量。
[0177] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了與GLP-2、GIP、胰高血糖素和胃泌酸調(diào)節(jié)素或 者其功能性類似物和/或其衍生物的聯(lián)用或共制劑。功能性類似物相相對于天然序列而言 可以含有1至10個(gè)氨基酸的插入、缺失和/或取代（共同地）。
[0178] 在不同實(shí)施方式中，所述聯(lián)用療法和/或共制劑包含與例如ELP或如本申請所述 的基質(zhì)形成成分的兩種或多種融合蛋白。在一些實(shí)施方式中，所述ELP包含VPGXG(SEQ ID NO: 3)的至少60個(gè)單元、或90個(gè)單元、或120個(gè)單元或者180個(gè)單元，其中X獨(dú)立地選自氨 基酸。在不同實(shí)施方式中，X是比例為5:3:2的V、G或A，或者比例為1:2:1的K、V或F，或 者比例為1:7:1的K、V或F，或者V。
[0179] 在不同實(shí)施方式中，組合物包含胰島素的持續(xù)釋放形式，其任選地包含胰島素的 速效形式，其每日在早飯前施用一次。 實(shí)施例
[0180] 實(shí)施例1--持續(xù)釋放腠島素構(gòu)律體
[0181] 將人胰島素原與ELP1-120生物聚合物基因融合并在大腸桿菌（E coli)的可溶性 成分中表達(dá)。在經(jīng)純化酶促過程將胰島素原部分轉(zhuǎn)化成成熟的胰島素后，在正常小鼠模型 中測定所述融合蛋白對葡萄糖的降低情況并與單獨(dú)的胰島素進(jìn)行比較。所述胰島素ELP融 合顯示出的對葡萄糖的降低情況與胰島素類似。此外，在該模型中所述融合蛋白的降低作 用與胰島素相比具有更長的持續(xù)時(shí)間。
[0182] 胰島素融合的構(gòu)建
[0183] 人胰島素原由B鏈和A鏈組成，其通過31個(gè)氨基酸的C肽連接在一起（圖1A和 1B)。一旦在A鏈和B鏈之間形成二硫鍵，胰島素原通過胰酶/羧肽酶B-樣系統(tǒng)除去C肽 轉(zhuǎn)化成在體內(nèi)成熟的胰島素?？梢允褂弥亟M的胰酶和羧肽酶B在體外復(fù)制這種肽的加工過 程。一旦所述融合在大腸桿菌的可溶性成份中表達(dá)，則再折疊步驟不是必需的。
[0184] 合成胰島素原核苷酸序列并將其亞克隆至基于pET的載體pPB1031中，其定位于 ELP1-120序列的N-末端以制備質(zhì)粒pPE0139(圖2)。
[0185] 圖3顯示了胰島素原ELP1-120融合蛋白（SEQ ID N0:14)的氨基酸序列。所述胰 島素原序列（下劃線）與ELP1-120序列融合。所述氨基酸序列任選地在N-末端包括起始 甲硫氨酸殘基。
[0186] 發(fā)酵
[0187] 在分批補(bǔ)料發(fā)酵工藝中，在T7啟動子的控制下將胰島素ELP融合質(zhì)粒pPE0139在 大腸桿菌的細(xì)胞內(nèi)成分中表達(dá)。使用兩階段搖瓶種子培養(yǎng)，使用含甘油的半定義的、無動物 培養(yǎng)基（ECPM+脯氨酸）作為主要碳源和酵母提取物作為主要氮源擴(kuò)增甘油細(xì)胞儲備液。在 種子培養(yǎng)階段獲得足夠的細(xì)胞密度后，將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至含有與種子培養(yǎng)階段相同培養(yǎng)基的 發(fā)酵罐中。通過PID控制將工藝參數(shù)（pH、溫度、溶解的氧）保持在設(shè)定點(diǎn)。使培養(yǎng)物生長 直至其達(dá)到穩(wěn)定期，隨后開始加入甘油/酵母提取物/硫酸鎂。將培養(yǎng)物維持在碳限定條 件下并且使用IPTG誘導(dǎo)啟動子。在發(fā)酵結(jié)束時(shí)，將培養(yǎng)物離心以便將含有胰島素ELP融合 的生物質(zhì)與廢棄的培養(yǎng)基分離。將細(xì)胞團(tuán)貯存在_70°C直至進(jìn)行隨后的純化。
[0188] 胰島素原ELP的純化
[0189] 將冷凍細(xì)胞團(tuán)在含有2M尿素的裂解緩沖液（用于使胰島素原ELP解離）中重懸 并混合直至均勻。使用微流化器進(jìn)行裂解以破壞細(xì)胞膜，然后通過離心進(jìn)行裂解物的初始 澄清。使用兩階段切向流過濾（TFF)系統(tǒng)進(jìn)一步澄清和濃縮產(chǎn)品。使用緩沖液將含有胰 島素原ELP融合的溶液調(diào)整濃縮至1M氯化鈉并通過疏水性相互作用色譜（HIC)柱（例如 TOSOH PPG 600M)作為捕獲步驟并且洗去宿主細(xì)胞污染物。梯度洗脫產(chǎn)品以分級分離所有 產(chǎn)品相關(guān)的雜質(zhì)（例如降解物質(zhì)）。在選定的組分上進(jìn)行TFF緩沖液交換以便在進(jìn)行胰島 素原ELP向胰島素ELP的酶促轉(zhuǎn)化之前除去殘留的鹽。
[0190] 胰島素原ELP融合的酶促過程
[0191] 通過使用重組胰酶和羧肽酶B酶促消化C-肽將經(jīng)純化的胰島素原ELP1-120轉(zhuǎn)化 為胰島素ELP，胰島素原與胰島素原ELP的比例分別為0. 05yg/mg和2. 0yg/mg。在室溫 下（20-25°C)孵育反應(yīng)3至4小時(shí)直至C-肽完全裂解以產(chǎn)生成熟的胰島素ELP。
[0192] 胰島素ELP的純化
[0193] 在轉(zhuǎn)化為胰島素ELP后，通過在捕獲HIC柱再處理胰島素ELP除去殘留的酶和產(chǎn) 物變體，其中胰島素ELP與該柱結(jié)合，殘留的酶通過該柱。對洗脫得到的產(chǎn)物組分進(jìn)行滲濾 以除去NaCl，然后通過離子交換（例如P0R0S 50 PI)對其進(jìn)行純化，其中離子交換的條件 為使產(chǎn)品流過，使宿主細(xì)胞污染物被捕獲。最后使用陽離子交換柱（例如P0R0S 50 HS)除 去產(chǎn)物變體、宿主細(xì)胞蛋白、內(nèi)毒素和DNA。然后將洗脫得到的產(chǎn)物濃縮和滲濾至制劑緩沖 液（例如 20mM 組氨酸，110mM NaCl，pH 7. 5)。
[0194] 非還原SDS-PAGE (圖4)顯示了在經(jīng)酶促處理后隨著C-肽的裂解預(yù)期減少的融合 蛋白分子量降低。
[0195] 進(jìn)行抗_胰島素B鏈western印跡（圖5)以確證存在與ELP融合的A鏈和B鏈。 數(shù)據(jù)顯示在非還原條件下存在B鏈，這表明在A鏈和B鏈之間形成了二硫鍵。對融合蛋白 和二硫鍵的還原導(dǎo)致從所述融合中除去了 B鏈。
[0196] 電噴霧離子化質(zhì)譜確證了胰島素原ELP融合的質(zhì)量（圖6)和在酶促除去C-肽后 成熟胰島素ELP融合的質(zhì)量（圖7)。在這兩個(gè)樣品中存在附加的鹽加合物。使用Ellman 試劑檢測確證存在二硫鍵。不存在游離的硫醇表明形成了二硫鍵。
[0197] 體內(nèi)葡萄糖降低
[0198] 將正常小鼠禁食過夜并皮下注射生理鹽水（陰性對照）、13nmol/kg甘精胰島素 (陽性對照）或35nmol/kg胰島素ELP融合（INSUMERA)。在給藥前和給藥后8小時(shí)至24小 時(shí)每小時(shí)獲取血糖讀數(shù)。在給藥后1小時(shí)提供食物。圖8顯示了血糖數(shù)據(jù)（平均值+-SE)。 與生理鹽水對照相比，所述胰島素ELP融合顯示了明顯的血糖降低。此外，所述胰島素ELP 融合顯示了血糖降低作用（7小時(shí)）長于甘精胰島素對照（2小時(shí)）。
[0199] 在1型糖尿病模型中的體內(nèi)作用
[0200] 在1型糖尿?。?型糖尿病，T1DM)小鼠模型中給予ELP-胰島素融合， INSUMERA(PE0139)。特別地，單次給藥數(shù)據(jù)如圖9所示。結(jié)果表明與等摩爾LANTUS(甘 精胰島素，SANOFI-AVENTIS)給藥相比，INSUMERA的血糖降低持續(xù)時(shí)間更長。當(dāng)以每日 方案給予所述化合物時(shí)（圖10)，結(jié)果表明在活性和半衰期方面與LANTUS(甘精胰島素， SANOFI-AVENTIS)相比，INSUMERA 具有優(yōu)效性。
[0201] 圖11A和11B顯示了在1型糖尿?。?型糖尿病，T1DM)小鼠模型中與LANTUS(甘 精胰島素，SANOFI-AVENTIS)相比INSUMERA(PE0139)具有低的劑量滴定。圖11A顯示了單 次s.c.給藥，圖11B 14天每日s.c.給藥。在這兩種情況下，均顯不了 INSUMERA的更加顯 著和持續(xù)的血糖降低作用。
[0202] 還進(jìn)行了研究以確定INSUMERA的血糖控制程度，對患者的典型血糖水平進(jìn) 行檢測。圖12A和11B顯示了相對于LANTUS(甘精胰島素，SANOFI-AVENTIS)而言， INSUMERA(PE0139)具有顯著增加的血糖控制。血糖曲線下面積（AUC)可見減少27-39%。 圖12A顯示了化合物施用第1天且在0-24hrs的血糖AUC。圖12B顯示了化合物施用第14 天且在0-24hrs的血糖AUC。在這兩個(gè)給藥方案中，INSUMERA對血糖AUC的降低比LANTUS 更有效。
[0203] 還進(jìn)行了研究以評估INSUMERA治療的藥代動力學(xué)（PK)。在糖尿病豬中，給予單次 s. c.注射（圖13A)或連續(xù)2周每日s. c.注射（圖13B)。結(jié)果顯示皮下注射后INSUMERA 具有長的半衰期和小的峰谷比值。
[0204] 胰島素/受體的相互作用
[0205] 下述研究的目的是對胰島素肽和胰島素肽/蛋白構(gòu)建體與人胰島素和IGF-1受體 的結(jié)合情況進(jìn)行附加檢測。
[0206] 分析條件：在25°C下使用配有鎳電荷NTA傳感器芯片和經(jīng)過運(yùn)行緩沖液（10mM 冊?￡5，150禮恥(：1，0.01%了￥6611-20卬117.8)平衡的祀3(3〇代551光學(xué)生物傳感器進(jìn)行結(jié) 合研究。針對這些研究，假定LCR-1054胰島素肽的分子量為5808Da以及INS-ELP(B30)和 PE0139的分子量為50, OOODa。
[0207] 還在更高濃度下對INS_ELP(B30)和PE0139進(jìn)行篩選。在早期檢測中，未觀察到 INS-ELP(B30)和PE0139的受體結(jié)合。在3yM下對這兩種待測物重新進(jìn)行檢測，并引入 LCR-1054(600nM)作為陽性對照。
[0208] 在3 yM時(shí)，INS-ELP(B30)和PE0139顯示出與胰島素受體表面的結(jié)合（圖35A)。 在3 yM時(shí)，INS-ELP(B30)和PE0139未顯示出與IGF-1受體顯著的結(jié)合（圖35B)。
[0209] 為了更加詳細(xì)的研究這些相互作用，制備新鮮的rhIR和rhIGF-lR的表面。捕獲 的帶His標(biāo)簽的rhIR的密度約1200RU。IGF-1R通過胺基偶聯(lián)于相同的芯片上，其密度為 7500RU。通過與600nM LCR-1054的結(jié)合確證這些新鮮的rhIR和rhIGF-lR表面的活性。
[0210] 系列濃度的INS-ELP(B30)和PE0139。在初始為20 yM的3倍系列稀釋中檢測 INS-ELP(B30)和PE0139與這兩種受體表面的結(jié)合。這兩種待測物顯示出與胰島素受體類 似的結(jié)合（圖36A)。
[0211] 將應(yīng)答對待測物濃度作圖并與樣品的結(jié)合等溫線進(jìn)行擬合以獲得這些相互作用 的親和性估計(jì)值（圖36B)。
[0212] 而相反的是，待測物均未顯示出與rhIGF-lR表面可靠的結(jié)合。事實(shí)上，在更高濃 度下來自該表面的應(yīng)答是負(fù)的，因?yàn)榕c固化的IGF-1R相比待測物與對照表面（傳感器芯片 上未連接蛋白的區(qū)域）顯示出更強(qiáng)的結(jié)合。
[0213] 因此，本實(shí)施例尤其顯示了在這些分析條件下INS-ELP(B30)和PE0139以約6-8uM 的親和性與胰島素受體結(jié)合，并且INS-ELP(B30)和PE0139未顯示出任何與IGF-1受體可 檢測的結(jié)合。
[0214] 隨后使用針對受體活化基于細(xì)胞的檢測對所述構(gòu)建體與IGF-1R的結(jié)合進(jìn)行了研 究，使用經(jīng)工程化改造的細(xì)胞以表達(dá)IGF受體。使用該系統(tǒng)，速效和持續(xù)釋放構(gòu)建體均顯示 出對IGF受體的一些活化作用，但是其水平顯著低于胰島素（數(shù)據(jù)未顯示）。
[0215] 實(shí)施例2-諫效腠島素構(gòu)律體
[0216] 為了制備"速效"胰島素ELP融合，在pPE0139中將胰島素原序列與長度短于120 個(gè)ELP五聚體重復(fù)的ELP聚合物基因性融合。這些更短的聚合物具有顯著高于生理?xiàng)l件的 轉(zhuǎn)變溫度，其有效地去除了所述聚合物的持續(xù)釋放功能，但是保留了其阻止胰島素多聚化 的能力并且使其在溶液中具有穩(wěn)定性。
[0217] 合成胰島素原核苷酸序列并使用限制性內(nèi)切酶將其亞克隆進(jìn)入基于pET的載體 PPE0221中。胰島素原的位置在ELP1-20序列的N-末端以制備質(zhì)粒pPE0224(圖17)。
[0218] 圖18顯示了胰島素原ELP1-20融合蛋白的氨基酸序列（SEQ ID N0:16)。胰島素 原序列（下劃線）與ELP1-20序列（粗體）融合。
[0219] 為構(gòu)建與長度短于ELP1-20的聚合物融合的胰島素原，合成所述胰島素原的核苷 酸序