列并將其亞克隆至基于pET的載體pPE0215中。胰島素原的該位置在ELP1-10序列的 N-末端以制備質(zhì)粒pPE0262(圖19)。
[0220] 圖20顯示了胰島素原ELP1-10融合蛋白的氨基酸序列（SEQ ID N0:17)。胰島素 原序列（下劃線）與ELP1-10序列（粗體）融合。
[0221] 為構(gòu)建與比ELP1-20的轉(zhuǎn)變溫度更高的聚合物融合的胰島素原，合成所述胰島素 原核苷酸序列并將其亞克隆至基于pET的載體pPE0245中。胰島素原的位置在ELP2-20序 列的N-末端以制備質(zhì)粒pPE0259 (圖21)。ELP2-20聚合物使用比例為1:1的丙氨酸和甘 氨酸作為VPGXG(SEQ ID N0:3)客體殘基，其與ELP1-20相比降低了所述聚合物的疏水性。
[0222] 圖22顯示了胰島素原ELP2-20融合蛋白的氨基酸序列（SEQ ID N0:18)。胰島素 原序列（下劃線）與ELP2-20序列（粗體）融合。
[0223] 為構(gòu)建與比ELP2-20長(zhǎng)度更短的聚合物融合的胰島素原，合成所述胰島素原核苷 酸序列并將其亞克隆至基于pET的載體pPE0265中。胰島素原的位置在ELP2-10序列的 N-末端以制備質(zhì)粒pPE0266 (圖23)。
[0224] 圖24顯示了胰島素原ELP2-10融合蛋白的氨基酸序列（SEQ ID N0:19)。胰島素 原序列（下劃線）與ELP2-10序列（粗體）融合。
[0225] 為構(gòu)建與比ELP1-10具有更多負(fù)電荷的聚合物融合的胰島素原，合成所述胰島素 原核苷酸序列并將其亞克隆至基于pET的載體pPE0274中。胰島素原的位置在ELP1-10序 列的N-末端，所述ELP1-10序列具有插入ELP五聚體之間的4個(gè)谷氨酸殘基，以制備質(zhì)粒 pPE0283(圖25)。所插入的谷氨酸殘基增加了所述聚合物的負(fù)電荷。
[0226] 圖26顯示了胰島素原ELP1-10 (4xGlu)融合蛋白的氨基酸序列（SEQ ID N0:20)。胰島素原序列（下劃線）與具有插入的所示谷氨酸殘基（粗體加下劃線）的 ELPl-10(4xGlu)序列（粗體）融合。
[0227] 為構(gòu)建與ELP聚合物融合的賴脯胰島素，合成所述賴脯胰島素的核苷酸序列并將 其亞克隆至基于pET的載體pPE0265中。賴脯胰島素的該位置在ELP1-10序列的N-末端 以制備質(zhì)粒PPE0284 (圖27)。
[0228] 圖28顯示了賴脯胰島素ELP1-10融合蛋白的氨基酸序列（SEQ ID N0:21)。賴脯 胰島素序列（下劃線）與ELP1-10序列（粗體）融合。
[0229] 為構(gòu)建與ELP聚合物融合的門冬胰島素，合成所述門冬胰島素的核苷酸序列并將 其亞克隆至基于pET的載體pPE0265中。門冬胰島素的該位置在ELP1-10序列的N-末端 以制備質(zhì)粒PPE0285 (圖29)。
[0230] 圖30顯示了門冬胰島素ELP1-10融合蛋白的氨基酸序列（SEQ ID N0:22)。門冬 胰島素序列（下劃線）與ELP1-10序列（粗體）融合。
[0231] 發(fā)酵
[0232] 在分批補(bǔ)料發(fā)酵工藝中，在T7啟動(dòng)子的控制下將上文所述的胰島素原ELP融合在 大腸桿菌的細(xì)胞內(nèi)成分中表達(dá)。使用兩階段搖瓶種子培養(yǎng)，使用含甘油的半定義的、無(wú)動(dòng)物 培養(yǎng)基（ECPM+脯氨酸）作為主要碳源和酵母提取物作為主要氮源擴(kuò)增甘油細(xì)胞儲(chǔ)備液。在 種子培養(yǎng)階段獲得足夠的細(xì)胞密度后，將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至含有與種子培養(yǎng)階段相同培養(yǎng)基的 發(fā)酵罐中。通過(guò)PID控制將工藝參數(shù)（pH、溫度、溶解的氧）保持在設(shè)定點(diǎn)。使培養(yǎng)物生長(zhǎng) 直至其達(dá)到穩(wěn)定期，隨后開(kāi)始加入甘油/酵母提取物/硫酸鎂。將培養(yǎng)物維持在碳限定條 件下并且使用IPTG誘導(dǎo)啟動(dòng)子。在發(fā)酵結(jié)束時(shí)，將培養(yǎng)物離心以便將含有胰島素ELP融合 的生物質(zhì)與廢棄的培養(yǎng)基分離。將細(xì)胞團(tuán)貯存在_70°C直至進(jìn)行隨后的純化。
[0233] 初始純化
[0234] 將冷凍細(xì)胞團(tuán)在含有2M尿素的裂解緩沖液（用于使胰島素ELP解離）中重懸并 混合直至均勻。使用微流化器進(jìn)行裂解以破壞細(xì)胞膜。通過(guò)離心進(jìn)行裂解物的初始澄清。 使用兩階段切向流過(guò)濾（TFF)系統(tǒng)進(jìn)一步澄清和濃縮產(chǎn)品。將胰島素原ELP融合通過(guò)HIC 柱作為捕獲步驟并洗去宿主細(xì)胞污染物。梯度洗脫產(chǎn)品以分級(jí)分離所有產(chǎn)品相關(guān)的雜質(zhì) (例如降解物質(zhì)）。使用PH7. 0-9. 0的Tris緩沖液在選定的組分上進(jìn)行TFF緩沖液交換以 便在進(jìn)行胰島素原ELP向胰島素ELP的酶促轉(zhuǎn)化之前除去殘留的鹽。
[0235] 胰島素原ELP融合的酶促過(guò)程
[0236] 通過(guò)使用重組胰酶和羧肽酶B酶促消化C-肽將捕獲的胰島素原ELP轉(zhuǎn)化為胰 島素ELP，胰島素原與胰島素原ELP的比例分別為0. 05 y g/mg和2. 0 y g/mg。在室溫下 (20-25°C )孵育反應(yīng)3至4小時(shí)直至C-肽完全裂解以產(chǎn)生成熟的胰島素ELP。
[0237] 最終的純化
[0238] 在轉(zhuǎn)化為胰島素ELP后，使用兩種方法除去殘留的酶和產(chǎn)物變體。一種方法是，通 過(guò)在捕獲HIC柱再處理胰島素ELP除去殘留的酶，其中胰島素ELP與該柱結(jié)合，殘留的酶通 過(guò)該柱。除去酶之后最終的精制步驟包括通過(guò)陽(yáng)離子交換柱以除去產(chǎn)物變體、宿主細(xì)胞蛋 白、內(nèi)毒素和DNA，和通過(guò)陰離子交換柱以除去任意殘留的DNA和內(nèi)毒素。或者，可以通過(guò)陽(yáng) 離子交換柱同時(shí)實(shí)現(xiàn)除去酶和精制步驟。酶緊密地與樹(shù)脂結(jié)合以使得能夠選擇性地洗脫胰 島素ELP，以便將產(chǎn)物與酶、宿主細(xì)胞蛋白、內(nèi)毒素和DNA分離。隨后使用陰離子交換柱除去 任意剩余的污染物。然后將洗脫得到的產(chǎn)物濃縮和滲濾至制劑緩沖液（例如20mM組氨酸， 110mM NaCl)。
[0239] 在1型糖尿病嚙齒動(dòng)物模型中PE0244(速效胰島素）和PE0139(持續(xù)釋放胰島 素）對(duì)葡萄糖水平的作用。
[0240] 采用已建立的方法通過(guò)施用鏈脲菌素（70mg/kgIP)在小鼠中誘導(dǎo)糖尿病。12天 后，將小鼠禁食4hr，然后給予PE0244、PE0139、PE0244和PE0139的共制劑、或載體。在注 射后至多4hr對(duì)血糖進(jìn)行檢測(cè)。圖Y顯示了由于胰島素快速進(jìn)入循環(huán)PE0244導(dǎo)致血糖迅 速降低，但是在觀察期結(jié)束時(shí)該作用開(kāi)始減弱。而相反的是，PE0139具有明顯慢的起效，這 是由于其從注射部位的儲(chǔ)庫(kù)中緩慢釋放，但是其作用能夠在整個(gè)觀察期中維持。聯(lián)用制劑 顯示出迅速起效和對(duì)血糖的持續(xù)降低，其清楚地顯示了在該共制劑中兩種分子保留了它們 的性質(zhì)。
[0241]ELP1-120序列改善了在大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)中的溶解度以及胰島素融合的下游處 理效率。利用這一優(yōu)勢(shì)將其與更短的ELP聚合物融合，將胰島素原ELP2-10聚合物與 ELPl-120mer聚合物的N-末端融合，在這兩者之間具有胰酶裂解位點(diǎn)。這使得所述聚合物 能夠一起表達(dá)并在純化工藝的酶促步驟中分離，結(jié)果導(dǎo)致與在PPE0266中表達(dá)的類似的胰 島素原ELP2-10融合。為構(gòu)建該"分離"構(gòu)建體，將ELP2-10聚合物的核苷酸序列與雙精氨 酸胰酶位點(diǎn)亞克隆至質(zhì)粒PPB1031中以形成質(zhì)粒pPE0289(圖31)。ELP2-10聚合物的該位 置在ELP1-120聚合物的N-末端上。接下來(lái)將胰島素原核苷酸序列克隆至ELP2-10序列的 N-末端上以制備質(zhì)粒pPE0290(圖32)。
[0242] 圖33顯示了胰島素原ELP2-10分離蛋白的氨基酸序列（SEQIDN0:23)。胰島素 原序列（下劃線）與ELP1-10序列（粗體）融合，其再與ELP1-120序列（斜體）融合。在 ELPS之間的胰酶位點(diǎn)已標(biāo)出（粗體加下劃線）。
[0243] 分離構(gòu)建體的加工
[0244]ELP1-120序列改善了在大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)中的溶解度以及胰島素融合的下游處 理效率。利用這一優(yōu)勢(shì)將其與更短的ELP聚合物融合，將胰島素原ELP2-10聚合物與 ELPl-120mer聚合物的N-末端融合，在這兩者之間具有胰酶裂解位點(diǎn)。這使得所述聚合物 能夠一起表達(dá)并在純化工藝的酶促步驟中分離，結(jié)果產(chǎn)生與在PPE0266中表達(dá)的類似的胰 島素原ELP2-10融合。為構(gòu)建該"分離"構(gòu)建體，將ELP2-10聚合物的核苷酸序列與雙精氨 酸胰酶位點(diǎn)亞克隆至質(zhì)粒PPB1031中以形成質(zhì)粒pPE0289(圖31)。ELP2-10聚合物的該位 置在ELP1-120聚合物的N-末端上。接下來(lái)將胰島素原核苷酸序列克隆至ELP2-10序列的 N-末端上以制備質(zhì)粒pPE0290(圖32)。
[0245] 圖33顯示了胰島素原ELP2-10分離蛋白的氨基酸序列（SEQIDN0:23)。胰島素 原序列（下劃線）與ELP1-10序列（粗體）融合，其再與ELP1-120序列（斜體）融合。在 ELPS之間的胰酶位點(diǎn)已標(biāo)出（粗體加下劃線）。
[0246]實(shí)施例3-持續(xù)釋放腠島素與GLP-1夸體激動(dòng)劑的聯(lián)用療法
[0247] 對(duì)持續(xù)釋放胰島素（PE0139)和GLP-1受體激動(dòng)劑的聯(lián)用療法進(jìn)行評(píng)估。GLP-1 受體激動(dòng)劑如3￡〇10勵(lì):32(?81023)所示，其包括￡1^1-120融合，其中乂是比例約5 :3:2 的Val、Gly和Ala。下述結(jié)果在db/db小鼠中獲得，并對(duì)不同劑量的活性劑對(duì)空腹血糖和 餐后血糖的作用進(jìn)行了評(píng)估。在0時(shí)刻前約3. 5小時(shí)對(duì)小鼠進(jìn)行禁食，在約240分鐘進(jìn)行 IPGTT〇
[0248] 圖37顯示了在db/db小鼠中PE0139劑量的增加對(duì)于空腹和餐后血糖顯示出增加 的作用。
[0249] 圖38顯示了在db/db小鼠中向PE0139中加入固定劑量的 PB1023 (GLP-1-ELP1-120)進(jìn)一步增強(qiáng) 了餐后控制。
[0250] 圖39顯示了在db/db小鼠中PB1023劑量的增加對(duì)空腹和餐后血糖顯示出增加的 作用。
[0251] 圖40顯示了在db/db小鼠中向PB1023中加入固定劑量的PE0139進(jìn)一步增強(qiáng)了 餐后控制。
[0252] 圖41顯示了PE0139的劑量增加對(duì)于血糖具有很小的影響，PB1023的劑量增加對(duì) 于空腹血糖顯示出增加的作用，對(duì)于餐后血糖具有有限的影響。
[0253] 圖42顯示了低劑量PE0139和PB1023聯(lián)用具有增強(qiáng)的空腹和餐后控制。
[0254] 等同物
[0255] 本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識(shí)到或者能夠確定，使用不超過(guò)常規(guī)的實(shí)驗(yàn)就能夠獲得本申 請(qǐng)所特別地描述的特定實(shí)施方式的多種等同物。此類等同物旨在包括在下述權(quán)利要求的范 圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種治療性蛋白，所述治療性蛋白包含胰島素B鏈和胰島素A鏈，以及抑制胰島素多 聚體形成的5至200個(gè)氨基酸的胰島素A鏈的融合伴侶。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療性蛋白，其中所述治療性蛋白與天然胰島素相比顯示出 IGF受體的降低的活化。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的治療性蛋白，其中所述融合伴侶具有約50至約150個(gè)氨 基酸。4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任意一項(xiàng)所述的治療性蛋白，其中所述融合伴侶具有包含重 復(fù)的(6-轉(zhuǎn)角的伸展構(gòu)象。5. 權(quán)利要求1至4中任意一項(xiàng)所述的治療性蛋白，其中所述融合伴侶的序列含有少 于約30 %的疏水性殘基，所述疏水性殘基選自亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、半胱氨 酸、組氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。6. 權(quán)利要求5所述的治療性蛋白，其中所述治療性蛋白在體溫不顯示相轉(zhuǎn)變。7. 根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的治療性蛋白，將其制成用于皮下注射的藥學(xué)上相容的溶 液。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的治療性蛋白，其中所述治療性蛋白在注射45分鐘內(nèi)達(dá)到胰島 素作用高峰。9. 根據(jù)權(quán)利要求1至8中任意一項(xiàng)所述的治療性蛋白，其中所述A鏈和B鏈具有SEQ ID NO: 13所示的氨基酸序列，所述氨基酸序列任選地具有1至8個(gè)修飾，所述修飾獨(dú)立地選 自氨基酸插入、氨基酸缺失或氨基酸取代。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的治療性蛋白，其中所述胰島素B鏈的位置3、28、29和30中 的一個(gè)或多個(gè)被取代，和/或所述A鏈的位置21被取代。11. 根據(jù)權(quán)利要求1至10中任意一項(xiàng)所述的治療性蛋白，其中所述A鏈和B鏈由一個(gè) 或多個(gè)二硫鍵結(jié)合，或經(jīng)由肽或化學(xué)接頭連接。12. 根據(jù)權(quán)利要求1至11中任意一項(xiàng)所述的治療性蛋白，其中所述融合伴侶包含ELP 單元。13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的治療性蛋白，其中所述融合伴侶包含約10至約25個(gè) VPGXG(SEQ ID N0:3)重復(fù)，其中X獨(dú)立地選自Val、Gly和Ala，或包含約10至25個(gè) AVGVP(SEQ ID NO:4)重復(fù)。14. 根據(jù)權(quán)利要求1至13中任意一項(xiàng)所述的治療性蛋白，其中所述融合伴侶包含1至 約10個(gè)帶負(fù)電的氨基酸。15. 根據(jù)權(quán)利要求13或14所述的治療性蛋白，其中G和A作為殘基X以大致相等的量 存在，和V作為X以高于G和/或A的頻率存在。16. 根據(jù)權(quán)利要求1至15中任意一項(xiàng)所述治療性蛋白，其中所述融合蛋白具有SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 17所示的序列。17. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的治療性蛋白，其中所述融合伴侶包含約10至約25個(gè)VPGXG 單元（SEQ ID NO: 3)，其中X獨(dú)立地選自V、G和A，其中G和A作為殘基X以大致相等的量 存在，和V作為X以低于G或A的頻率存在。18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的治療性蛋白，其中所述融合蛋白具有SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO:21 或 SEQ ID NO:22 所示的序列。19. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的治療性蛋白，其具有2至6個(gè)帶正電的殘基。20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的治療性蛋白，其中所述融合蛋白具有SEQ ID N0:20所示的 氨基酸序列。21. -種藥物組合物，所述藥物組合物包含權(quán)利要求1至20中任意一項(xiàng)所述的第一融 合蛋白，和包含胰島素B鏈和胰島素A鏈的第二融合蛋白，以及約400至約1000個(gè)氨基酸 的融合伴侶，所述第二融合蛋白在體溫顯示出相轉(zhuǎn)變以提供所述第二融合蛋白從注射部位 的持續(xù)釋放。22. 根據(jù)權(quán)利要求21所述的藥物組合物，其中所述第二融合蛋白具有帶有伸展構(gòu)象的 融合伴侶，所述伸展構(gòu)象包含重復(fù)的(6-轉(zhuǎn)角。23. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的藥物組合物，其中所述第一融合蛋白具有包含 [VPGXG]12Q(SEQ ID NO:29)的融合伴侶，其中各X選自V、G和A，并且其中V:G:A的比例約 為 5:3:2〇24. 根據(jù)權(quán)利要求21至23中任意一項(xiàng)所述的藥物組合物，用于每日施用一次。25. 根據(jù)權(quán)利要求21至24中任意一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述第一和第二融合蛋 白是通過(guò)蛋白水解加工從單一的融合蛋白分離得到。26. 根據(jù)權(quán)利要求21至25中任意一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述藥物組合物包含約 1:1比例的所述第一和第二融合蛋白。27. -種用于治療糖尿病或低胰島素血癥的方法，所述方法包括：給予有此需要的患 者權(quán)利要求1至20中任意一項(xiàng)所述的治療劑或權(quán)利要求21至26所述的藥物組合物。28. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述患者患有1型或2型糖尿病或者前驅(qū)糖尿 病。29. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述治療性蛋白每日施用1至3次，或者所述藥 物組合物每日施用一次。30. 根據(jù)權(quán)利要求26至29中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述治療性蛋白或藥物組合物 在餐前約15分鐘或更短時(shí)施用。31. -種用于治療糖尿病或低胰島素血癥的方法，所述方法包括：給予患者速效餐時(shí) 胰島素，和長(zhǎng)效基礎(chǔ)胰島素，其中所述速效胰島素是權(quán)利要求1至20中任意一項(xiàng)所述的治 療性蛋白；和/或所述長(zhǎng)效胰島素包含胰島素B鏈和胰島素A鏈，和約400至約1000個(gè)氨 基酸的融合伴侶，所述長(zhǎng)效胰島素在體溫顯示出相轉(zhuǎn)變以提供從注射部位的持續(xù)釋放。32. 根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述長(zhǎng)效胰島素具有帶有伸展構(gòu)象的融合伴 侶，所述伸展構(gòu)象包含重復(fù)的(6-轉(zhuǎn)角。33. 根據(jù)權(quán)利要求31或32所述的方法，其中所述長(zhǎng)效胰島素每周施用一次或每日施用 一次。34. 根據(jù)權(quán)利要求31至33中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述速效胰島素在開(kāi)始進(jìn)餐前 每日施用1次至3次。35. 根據(jù)權(quán)利要求31至34中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述患者患有1型或2型糖尿 病或者前驅(qū)糖尿病。36. 根據(jù)權(quán)利要求31至35中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述速效胰島素和所述長(zhǎng)效胰 島素通過(guò)監(jiān)測(cè)血糖的栗系統(tǒng)施用。37. -種用于治療糖尿病、代謝疾病或臨床肥胖癥的方法，所述方法包括：給予長(zhǎng)效胰 島素方案，所述長(zhǎng)效胰島素包含胰島素B鏈和胰島素A鏈，以及約400至約1000個(gè)氨基酸 的融合伴侶，所述長(zhǎng)效胰島素在體溫顯示出相轉(zhuǎn)變以提供從注射部位的持續(xù)釋放，和給予 GLP-I受體激動(dòng)劑方案。38. 根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中所述GLP-I受體激動(dòng)劑是GLP1-ELP1-120。39. 根據(jù)權(quán)利要求37或38所述的方法，其中所述長(zhǎng)效胰島素和所述GLP-I受體激動(dòng) 劑各具有包含[VPGXG]12Q(SEQ ID NO:29)的融合伴侶，其中各X選自V、G和A，和其中所述 V:G:A的比例為約5:3:2。40. 根據(jù)權(quán)利要求37至39中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述胰島素和所述GLP-I受體 激動(dòng)劑分開(kāi)或一起配制。41. 根據(jù)權(quán)利要求37至40中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述胰島素和所述GLP-I受體 激動(dòng)劑共配制和約每周施用一次。42. -種融合蛋白，所述融合蛋白包含速效胰島素和長(zhǎng)效胰島素，以及連接所述速效胰 島素和所述長(zhǎng)效胰島素的蛋白酶位點(diǎn)。
【專利摘要】本發(fā)明部分地涉及具有治療益處的胰島素蛋白和藥物組合物。肽和小分子藥物的有效性通常受到此類藥物在循環(huán)中的半衰期以及難以獲得基本上恒定的血漿水平的限制。例如，腸促胰島素GLP-1必須以相對(duì)較高的劑量施用以克服其在循環(huán)中較短的半衰期，此外這些較高的劑量與惡心相關(guān)。Murphy和Bloom,非肽類胰高血糖素樣肽1受體激動(dòng)劑：是治療糖尿病的魔彈嗎。
【IPC分類】A61K38/28
【公開(kāi)號(hào)】CN105025919
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201480012956
【發(fā)明人】J.喬伊特, C.伍茲, S.阿諾德, D.J.巴蘭斯
【申請(qǐng)人】費(fèi)斯生物制藥公司
【公開(kāi)日】2015年11月4日
【申請(qǐng)日】2014年1月15日
【公告號(hào)】EP2945643A1, US20150361154, WO2014113434A1