度（微克/毫升）
[0132]Peff:有效穿透率（公分/秒）
[0133]J:流量（微克/平方公分?秒）
[0134]A:擴散表面積（平方公分）
[0136] 3. 2. 5體外人體細胞株穿透試驗
[0137] 將RPMI2650細胞（即，人類鼻中膈鱗狀細胞株）接種于涂布有膠原蛋白之孔徑 為0.4微米的細胞隔膜盤（cellinsert)中，并培養(yǎng)2天，使細胞在細胞隔膜上形成細胞單 層膜（monolayer)。接著，將細胞隔膜盤轉(zhuǎn)移到已加入1. 5毫升Hepes緩沖液的12孔盤中， 再于細胞隔膜盤中加入〇. 5毫升的含亞丁基苯酞原液或醫(yī)藥組合物的H印es緩沖液。然后， 將12孔盤置于37°C、5% 0)2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每間隔1小時，分別收集12孔盤內(nèi)的緩沖 液，并以分光光度計測量其于310納米波長下的吸收光譜，計算亞丁基苯酞或醫(yī)藥組合物 濃度，共測量6小時，并利用前述公式1及公式2,計算求得有效穿透（Prff)與流量（J)。
[0138] 3. 3試驗結(jié)果
[0139] 3. 3. 1低溫穩(wěn)定性測試結(jié)果
[0140] 以第3. 2. 1點所載方法測試醫(yī)藥組合物1、比較醫(yī)藥組合物1、醫(yī)藥組合物5及醫(yī) 藥組合物6于低溫下的穩(wěn)定性，結(jié)果如圖2A及圖2B所示，其中圖2A及圖2B分別為儲存前 及儲存后的照片。由圖2A及圖2B可知，本發(fā)明醫(yī)藥組合物（醫(yī)藥組合物1、5及6)在4°C 低溫下長時間儲存（長達30天）前后外觀不會有顯著變化且不會分層，而非本發(fā)明醫(yī)藥組 合物（比較醫(yī)藥組合物1)在4°C低溫下儲存后則有明顯分層的現(xiàn)象。前述結(jié)果顯示，本發(fā) 明醫(yī)藥組合物的穩(wěn)定性優(yōu)異。
[0141] 3. 3. 2毒殺試驗結(jié)果：以第3. 2. 2點所載方法對亞丁基苯酞原液、醫(yī)藥組合物1、比 較醫(yī)藥組合物1、醫(yī)藥組合物5及醫(yī)藥組合物6進行毒殺試驗，結(jié)果如圖3及表8所示。由 圖3可知，相較于控制組，GBM8401細胞的存活率系隨著活性成分亞丁基苯酞的劑量提高 而下降，且各醫(yī)藥組合物中，以醫(yī)藥組合物5的毒殺效果最好，其抑制GBM8401細胞的存活 的IC5。為28. 20微克/毫升。
[0142]表 8
[0145] 3. 3. 3毒殺效果穩(wěn)定度試驗結(jié)果
[0146] 以第3. 2. 3點所載方法對醫(yī)藥組合物5進行毒殺效果穩(wěn)定度試驗，結(jié)果如圖4所 示。由圖4可知，相較于控制組，不論醫(yī)藥組合物5的儲存時間如何，經(jīng)處理后的各組GBM 8401細胞的存活率仍保持著隨著活性成分亞丁基苯酞的劑量提高而下降的規(guī)律。前述結(jié)果 顯示，醫(yī)藥組合物5對惡性腦瘤細胞的毒殺效果并不會受到儲存時間的影響，為一穩(wěn)定的 配方。
[0147] 3. 3. 4體外人工纖維膜穿透試驗結(jié)果
[0148] 以第3. 2. 4點所載方法對亞丁基苯酞原液、醫(yī)藥組合物1、比較醫(yī)藥組合物1、醫(yī)藥 組合物5及醫(yī)藥組合物6進行體外人工纖維膜穿透試驗，結(jié)果記錄于下表9。由表9可知， 醫(yī)藥組合物5和醫(yī)藥組合物6的有效穿透率（Prff)最高，而亞丁基苯酞原液的有效穿透率 最低。前述結(jié)果顯示，相較于亞丁基苯酞原液，本發(fā)明醫(yī)藥組合物的穿透能力明顯較佳，其 中又以醫(yī)藥組合物5和醫(yī)藥組合物6的穿透能力為最佳。
[0149]表 9
[0150]
[0152] 3. 3. 5體外人體細胞株穿透試驗結(jié)果
[0153] 以第3. 2. 5點所載方法對亞丁基苯酞原液、醫(yī)藥組合物1、比較醫(yī)藥組合物1、醫(yī)藥 組合物5及醫(yī)藥組合物6進行體外人體細胞株穿透試驗，結(jié)果記錄于下表10。由表10可 知，醫(yī)藥組合物6的有效穿透率（Prff)最高，而亞丁基苯酞原液的有效穿透率最低。前述結(jié) 果顯示，相較于亞丁基苯酞原液，本發(fā)明醫(yī)藥組合物穿透細胞的能力明顯較佳，其中又以醫(yī) 藥組合物5及6的穿透細胞的能力為佳。
[0154]表10
[0155]
[0156] 4.醫(yī)藥組合物的動物實驗
[0157] 4.1實驗方法
[0158] 于大鼠顱內(nèi)植入9L(即，大鼠惡性腦瘤細胞株）腫瘤組織，待顱內(nèi)生成腫瘤后再 進行藥物治療試驗。試驗方法包括：（i)利用400毫克/公斤體重的水合氯醛（chloral hydrate) (Sigma-Aldrich公司）麻醉大鼠，待其昏迷后，將大鼠頭部毛發(fā)剃除，并將大鼠保 持固定于鼠腦定位儀（LabStandard?StereotaxicInstrument)上；（ii)以大剪將頭皮剪 開以露出頭蓋骨，以腦部囪門（bregma)為中心，向右3毫米，向下5毫米，到定位鉆孔處， 利用鉆孔器將頭蓋骨磨出5毫米直徑的空洞；（iii)用鑷子夾取預先準備好的9L腫瘤組織 (IXIX1立方毫米）并植入腦內(nèi)3毫米深處，靜置1分鐘待血液凝固后取出鎳子，并于空洞 處涂上骨臘，最后將大鼠頭皮縫合，并給予抗生素；（iv)待植入腫瘤組織后第7天，隨機分 組如下表11，并利用微量吸管吸取藥物（亞丁基苯酞原液或醫(yī)藥組合物5)滴進大鼠鼻腔 中，進行鼻內(nèi)投藥治療，連續(xù)投藥30天，并于期間記錄大鼠體重及死亡只數(shù)；以及（V)取下 腫瘤，利用電子式游標卡尺來測量腫瘤的長和寬，并且用下列公式3計算腫瘤之總體積，同 時測量腫瘤重量，將測得之數(shù)值繪制成長條圖與曲線圖，以判斷治療成效。
[0159]表11
[0160]
[0163] 4. 2動物實驗結(jié)果
[0164] 以第4. 1點所載方法進行動物實驗，實驗結(jié)果如圖6及圖7A至7C所示。由圖6 及圖7A至7C可知，相較于控制組，亞丁基苯酞原液（160毫克/公斤）及亞丁基苯酞原液 (320毫克/公斤）皆具有抑制腫瘤生長的效果。前述結(jié)果顯示，經(jīng)由鼻內(nèi)投予BP原液，確 實可提供治療惡性腫瘤的效果。
[0165] 由圖6及圖7A至7C亦可知，經(jīng)鼻內(nèi)投予亞丁基苯酞原液（160毫克/公斤）與醫(yī) 藥組合物5 (80毫克/公斤）30天后，該二組大鼠具有明顯提升且相似的存活率、以及明顯 下降且相似的腫瘤體積及腫瘤重量。此結(jié)果顯示，本發(fā)明醫(yī)藥組合物中的亞丁基苯酞的有 效劑量，只需要亞丁基苯酞原液的有效劑量的一半，即可達到相同的治療效果。
[0166] 由圖7B、7C可知，投予醫(yī)藥組合物5 (160毫克/公斤）30天后，該組腫瘤重量可減 少約92% (圖7B)，而腫瘤體積可減少約94% (圖7C)。前述結(jié)果顯示，本發(fā)明醫(yī)藥組合物 5 (160毫克/公斤）具有優(yōu)異的治療惡性腫瘤的效果。
[0167] 以上體外及動物實驗結(jié)果皆顯示，將亞丁基苯酞制成如本發(fā)明的醫(yī)藥組合物，可 提高鼻內(nèi)投藥后活性成分穿透鼻腔粘膜的效率，加乘其治療效果，尤其是治療惡性腦瘤的 功效。
[0168] 上述實施例僅用以例示說明本發(fā)明的原理及功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟 于此項技藝之人士均可在不違背本發(fā)明的技術(shù)原理及精神的情況下，對上述實施例進行修 改及變化。因此，本發(fā)明的權(quán)利保護范圍應如所附申請專利權(quán)利要求所界定。
【主權(quán)項】
1. 一種穩(wěn)定醫(yī)藥組合物，包含： (a) -介質(zhì)系統(tǒng)，包含第一成分、第二成分、及第三成分，該第一成分為磷酸鹽緩沖液 (phosphate buffered saline)，該第二成分選自以下群組：植物油、動物油、脂肪酸、及其 組合，且該第三成分選自以下群組：聚乙二醇、二甲亞砜、乙醇、聚丙二醇、聚山梨醇酯、聚 氧乙基化蔬菜油（polyoxyethylated vegetable oil)、乙酸乙酯、12-羥基硬酯酸輕乙酯 (2-hydroxyethyl 12-hydroxyoctadecanoate)、維生素 E 聚乙二醇琥泊酸酯（tocopheryl polyethylene glycol succinate)、及其組合；以及 (b) 亞丁基苯釀（n-butylidenephthalide，BP)〇2. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其中該植物油選自以下群組：芥花油、椰子油、玉米油、 棉籽油、橄欖油、棕櫚油、花生油、菜籽油、紅花籽油、芝麻油、大豆油、葵花油、杏仁油、腰果 油、榛果油、胡桃油、山核桃油、松子油、開心果油、蓖麻油（castor oi 1)及其組合；且該動物 油選自以下群組：魚油、魚肝油、豬油、牛油、羊油、雞油、鴨油及其組合。3. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其中該第二成分為經(jīng)修飾的蓖麻油（modified castor oil)。4. 如權(quán)利要求3所述的組合物，其中該經(jīng)修飾的蓖麻油為聚乙氧化蓖麻油 (polyethoxylated castor oil)，且該第三成分選自以下群組：聚乙二醇、二甲亞砜、乙醇、 聚丙二醇、及其組合。5. 如權(quán)利要求4所述的組合物，其中該第三成分選自以下群組：聚乙二醇、二甲亞砜、 乙醇、及其組合。6. 如權(quán)利要求5所述的組合物，其中該第三成分為聚乙二醇與二甲亞砜的組合或聚乙 二醇與乙醇的組合。7. 如權(quán)利要求6所述的組合物，其中該第三成分為聚乙二醇與二甲亞砜的組合。8. 如權(quán)利要求1至7中任一項所述的組合物，其中以每毫升（a)介質(zhì)系統(tǒng)計，（b)亞丁 基苯酞的濃度為〇. 001暈克/毫升至1500暈克/毫升。9. 如權(quán)利要求1至7中任一項所述的組合物，其中于（a)介質(zhì)系統(tǒng)中，第一成分與第二 成分的體積比為1:2至20:1，且第一成分與第三成分的體積比為1 :2至30 :1。
【專利摘要】一種穩(wěn)定醫(yī)藥組合物，包含：（a）一介質(zhì)系統(tǒng)，包含第一成分、第二成分、及第三成分，該第一成分為磷酸鹽緩沖液，該第二成分選自以下群組：植物油、動物油、脂肪酸及其組合，且該第三成分選自以下群組：聚乙二醇、二甲亞砜、乙醇、聚丙二醇、聚山梨醇酯、聚氧乙基化蔬菜油、乙酸乙酯、12-羥基硬酯酸羥乙酯、維生素E聚乙二醇琥珀酸酯、及其組合；以及（b）亞丁基苯酞（n-butylidenephthalide，BP）。
【IPC分類】A61P35/00, A61K47/44, A61K31/365, A61K47/34
【公開號】CN105030760
【申請?zhí)枴緾N201510191893
【發(fā)明人】林欣榮, 韓鴻志, 邱紫文, 邱郁涵
【申請人】長弘生物科技股份有限公司
【公開日】2015年11月11日
【申請日】2015年4月22日
【公告號】US20150306233