一種具有man和wga修飾的雙重靶向脂質(zhì)體及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種具有MAN和WGA修飾的雙重靶向脂質(zhì)體及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前臨床上腦膠質(zhì)瘤的治療仍面臨著巨大挑戰(zhàn)，非侵入性診斷與治療成為腦膠質(zhì) 瘤治療的一個新方向，為提高治療效果和延長患者的生存時間帶來了希望。但是大部分的 治療藥物并沒有很好的治療效果，原因如下：（1)由于血腦屏障的存在，98%的小分子藥物 和幾乎全部的大分子藥物都不能進(jìn)入大腦內(nèi)部的腫瘤部位發(fā)揮治療作用；(2)能透過血腦 屏障的治療藥物不能很好的在腫瘤部位富集，大部分?jǐn)U散到正常的腦組織，引起嚴(yán)重的不 良反應(yīng)，甚至導(dǎo)致患者死亡。因此想要有效的治療腦膠質(zhì)瘤需要克服兩個障礙：血腦屏障和 腦-膠質(zhì)瘤屏障。為滿足腦膠質(zhì)瘤的治療需求，研究一種新的給藥系統(tǒng)既能使藥物透過血 腦屏障又能靶向腦膠質(zhì)瘤在腫瘤部位盡可能的富集，這樣既能減少治療藥物對正常腦組織 的毒副作用，又能提尚治療效果。
[0003] 表阿霉素（Epirubicin，EPI)為阿霉素的一種新的蒽環(huán)霉素衍生物，是一種廣譜 的抗腫瘤藥物，對多種腫瘤具有抑制作用，其作用機(jī)制主要為：表阿霉素分子插入DNA鏈從 而抑制DNA和RNA的合成；表阿霉素通過拓?fù)洚悩?gòu)酶II觸發(fā)DNA裂解，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。目 前臨床上已將表阿霉素用于乳腺癌、非霍奇金淋巴瘤、卵巢癌、軟組織肉瘤、胰腺癌、胃癌、 小細(xì)胞肺癌和急性白血病。與阿霉素相比，在相似的劑量下，表阿霉素表現(xiàn)出更小的血液 和心臟毒性。在一些體外的研究實(shí)驗(yàn)中，表阿霉素對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有很強(qiáng)的抑制作用， 然而體內(nèi)光學(xué)成像觀測結(jié)果表明，受血腦屏障保護(hù)的大腦區(qū)域未檢測到表阿霉素。原因 是由于血腦屏障的存在，表阿霉素?zé)o法到達(dá)腦組織對腦膠質(zhì)瘤發(fā)揮治療作用。白黎蘆醇 (resveratrol，RES)是一種主要存在于葡萄中的天然分子，具有多種生物學(xué)效應(yīng)，如抗腫 瘤、抗氧化、抗突變、抗炎癥以及降低血糖等，它對腫瘤的發(fā)生、促進(jìn)和發(fā)展3個階段都有明 顯的抑制作用。白藜蘆醇抗腫瘤的作用機(jī)制是通過抑制癌細(xì)胞合成、阻滯細(xì)胞周期、誘導(dǎo)癌 細(xì)胞凋亡、抑制酶類并干擾相關(guān)信號傳導(dǎo)通路而發(fā)揮抗腫瘤作用，并且體內(nèi)研究表明無明 顯的毒副作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種具有MAN和WGA修飾的雙重靶向脂質(zhì)體及其制備方法和 應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明提供的雙重靶向脂質(zhì)體，由脂質(zhì)體和其表面的修飾物組成，其特征在于：所 述脂質(zhì)體表面的修飾物為4-氨基苯-a-D-吡喃甘露糖苷和麥胚凝集素。
[0006] 所述4-氨基苯_a-D-吡喃甘露糖苷可連接于所述脂質(zhì)體的氨基上；所述麥胚凝 集素可連接于所述脂質(zhì)體的羧基上。所述脂質(zhì)體的氨基可由dspe-peg2_-nh2提供；所述脂 質(zhì)體的羧基可由DSPE-PEG2QQQ-C00H提供。
[0007] 具體來說：所述脂質(zhì)體制備時，可在原料中加入DSPE-PEG2_-MaP DSPE-PEG2。。。-C00H，DSPE-PEG2_-MaPDSPE-PEG2_-C00H結(jié)合到脂質(zhì)體表面，提供用于連接 4-氨基苯-a-D-吡喃甘露糖苷和麥胚凝集素的氨基和羧基。
[0008] 所述脂質(zhì)體具體可用蛋黃卵磷脂、膽固醇、dspe-peg2_、dspe-peg2。。。-C00H和 DSPE-PEG2_-NH2作為原料制備得到。蛋黃卵磷脂、膽固醇、DSPE-PEG2_、DSPE-PEG2QQQ-C00H 和DSPE-PEG2Q(M-NH2的摩爾比可為（50-55) : (40-45) :4 : (0? 25-0. 75) : (0? 25-0. 75)。蛋 黃卵磷脂、膽固醇、dspe-peg2。。。、dspe-peg2QQQ-cooh和dspe-peg2QQQ-nh2的摩爾比具體可為 52:43:4:0. 5:0. 5。
[0009] 所述靶向脂質(zhì)體中，所述麥胚凝集素的質(zhì)量與制備所述脂質(zhì)體時蛋黃卵磷脂和膽 固醇的質(zhì)量之和的配比可為（4-6) :30,具體可為5:30,所述4-氨基苯-a-D-吡喃甘露糖 苷的質(zhì)量與制備所述脂質(zhì)體時蛋黃卵磷脂和膽固醇的質(zhì)量之和的配比可為（1-2) : 30,具體 可為 1. 5:30。
[0010] 本發(fā)明還提供了一種靶向脂質(zhì)體的制備方法，包括如下步驟：
[0011] 1)以蛋黃卵磷脂、膽固醇、dspe-peg2。。。、dspe-peg2WM-cooh和dspe-peg2_-nh# 原料制備表面具有氨基和羧基的脂質(zhì)體；
[0012] 2)將4-氨基苯-a-D-吡喃甘露糖苷與步驟1)制備的脂質(zhì)體的氨基連接，將麥胚 凝集素與步驟1)制備的脂質(zhì)體的羧基連接；
[0013] 得到靶向脂質(zhì)體。
[0014] 所述步驟1)中，制備脂質(zhì)體的方法具體如下：
[0015]將蛋黃卵磷脂、膽固醇、dspe-peg2。。。、dspe-peg2QQQ-cooh和dspe-peg2QQQ-nh2 溶解在 甲醇中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去甲醇，35°c、40rpm旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，然后加入250mM硫酸銨水溶液，然 后進(jìn)行超聲處理（超聲參數(shù)：每工作l〇s停30s，全程時間為lOmin，保護(hù)溫度為35°C)，然 后使用脂質(zhì)體擠壓器分別過400nm聚碳脂膜3次和200nm聚碳脂膜3次（順序如下：400nm 聚碳脂膜一400nm聚碳脂膜一400nm聚碳脂膜一200nm聚碳脂膜一200nm聚碳脂膜一200nm 聚碳脂膜），然后裝在透析袋中并置于PH7. 4的PBS緩沖液中透析，得到脂質(zhì)體。
[0016] 所述步驟2)中，可用戊二醛作連接劑，將4-氨基苯-a-D-吡喃甘露糖苷與脂質(zhì) 體的氨基（由DSPE-PEG2QQQ-NH2提供）連接。
[0017] 所述步驟2)中，可用EDCI作連接劑，將麥胚凝集素與脂質(zhì)體的羧基（由 dspe-peg2M(]-cooh提供）連接。
[0018] 所述步驟1)中，蛋黃卵磷脂、膽固醇、dspe-peg2_、dspe-peg2QQQ-cooh和 DSPE-PEG2_-NH2的摩爾比可為（50-55) : (40-45) :4 : (0? 25-0. 75) : (0? 25-0. 75)。所述步 驟 1)中，蛋黃卵磷脂、膽固醇、dspe-peg2。。。、dspe-peg2QQQ-cooh和dspe-peg2QQQ-nh2的摩爾 比具體可為 52:43:4:0. 5:0. 5。
[0019] 所述的靶向脂質(zhì)體可應(yīng)用于制備藥物載體。所述藥物具體可為鹽酸表阿霉素和/ 或白藜蘆醇。
[0020] 本發(fā)明還保護(hù)一種藥物載體，它的活性成分為所述的靶向脂質(zhì)體。所述藥物具體 可為鹽酸表阿霉素和/或白藜蘆醇。
[0021] 本發(fā)明還保護(hù)一種載藥脂質(zhì)體，是用所述的靶向脂質(zhì)體包載藥物得到的。所述藥 物具體可為鹽酸表阿霉素和/或白藜蘆醇。
[0022] 所述載藥脂質(zhì)體的制備方法具體如下：
[0023] (1)將白藜蘆醇、蛋黃卵磷脂、膽固醇、dspe-peg2。。。、DSPE-PEG2M〇-COOH和 DSPE-PEG2。。。-NH2溶解在甲醇中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去甲醇，35°C、40rpm旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，然后加入 250mM硫酸銨水溶液，然后進(jìn)行超聲處理（超聲參數(shù)：每工作10s停30s，全程時間為lOmin， 保護(hù)溫度為35°C)，然后使用脂質(zhì)體擠壓器分別過400nm聚碳脂膜3次和200nm聚碳脂膜 3次（順序如下：400nm聚碳脂膜一400nm聚碳脂膜一400nm聚碳脂膜一200nm聚碳脂膜 -200nm聚碳脂膜一200nm聚碳脂膜），然后裝在透析袋中并置于pH7. 4的PBS緩沖液中透 析，得到脂質(zhì)體A0;
[0024] (2)用戊二醛作連接劑，將4-氨基苯-a-D-吡喃甘露糖苷與脂質(zhì)體A0的氨基（由 DSPE-PEG2M(]-NH2提供）連接，得到脂質(zhì)體B0;
[0025] (3)用EDCI作連接劑，將麥胚凝集素與脂質(zhì)體B0的羧基（由DSPE-PEG2QQQ-C00H提 供）連接，得到脂質(zhì)體DO;
[0026] (4)將鹽酸表阿霉素與脂質(zhì)體DO混合，反應(yīng)（具體可60°C、左右振蕩、120次/min 振蕩20min)后得到脂質(zhì)體D1 (包載酸表阿霉素和白藜蘆醇的載藥脂質(zhì)體）。
[0027] 步驟⑴中，白藜蘆醇的加入質(zhì)量為蛋黃卵磷脂和膽固醇的質(zhì)量之和的配比為1: 30 〇
[0028] 步驟（4)中，鹽酸表阿霉素的加入質(zhì)量與步驟（1)中蛋黃卵磷脂和膽固醇的質(zhì)量 之和的配比為=1 :12。
[0029] 所述步驟⑴中，蛋黃卵磷脂、膽固醇、DSPE-PEG2。。。、DSPE-PEG2。。。-C00H和 DSPE-PEG2_-NH2的摩爾比可為（50-55) : (40-45) :4 : (0? 25-0. 75) : (0? 25-0. 75)。所述步 驟⑴中，蛋黃卵磷脂、膽固醇、DSPE-PEG2。。。、DSPE-PEG2QQQ-C00H和DSPE-PEG2QQQ-NH2的摩爾 比具體可為 52:43:4:0. 5:0. 5。
[0030] 本發(fā)明還保護(hù)一種治療腦腫瘤的藥物，它的活性成分是包載鹽酸表阿霉素和/或 白藜蘆醇的載藥脂質(zhì)體。所述腦腫瘤可為腦膠質(zhì)瘤，具體可為C6大鼠腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞引起的 腦膠質(zhì)瘤。
[0031] 所述包載鹽酸表阿霉素和/或白藜蘆醇的載藥脂質(zhì)體可應(yīng)用于制備治療腦腫瘤 的藥物。所述腦腫瘤可為腦膠質(zhì)瘤，具體可為C6大鼠腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞引起的腦膠質(zhì)瘤。
[0032]MAN在協(xié)助藥物載體透過血腦屏障方面，具有很好的效果。由于GLUT1在血腦屏障 和腦腫瘤細(xì)胞上高表達(dá)，且MAN對GLUT1具有特定的親和力，所以本發(fā)明將MAN作為靶向配 體連接到脂質(zhì)體表面，將在協(xié)助載藥脂質(zhì)體透過血腦屏障方面發(fā)揮重要作用，同時MAN還 能夠增強(qiáng)載藥脂質(zhì)體靶向腦腫瘤細(xì)胞的能力。麥胚凝集素WGA可作為有效靶向血腦屏障的 藥物載體配體，主要原因是WGA相對于其他凝集素具有較高的親和力及較低的大腦毛細(xì)血 管內(nèi)皮細(xì)胞毒性。麥胚凝集素對惡性腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出的高度傾向性，促進(jìn)了凝集素作為協(xié) 助腫瘤治療方面的發(fā)展。