、脂質(zhì)體Cl、B1、 A2相比，脂質(zhì)體D1在C6大鼠腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)分布量最多，與流式法檢測C6大鼠腦膠質(zhì)瘤 細(xì)胞的攝取作用一致。
[0120] 實(shí)施例5、載藥脂質(zhì)體體外對C6大鼠腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡作用研究
[0121] 藥物的加入形式為脂質(zhì)體時(shí)，鹽酸表阿霉素的加入量為脂質(zhì)體的加入量乘以包封 率。
[0122] 1、取對數(shù)生長期的C6大鼠腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞，以2X105個(gè)/孔（2000yL/孔）接種 于6孔板中，置于37°C、5%C02條件下培養(yǎng)24h。
[0123] 2、完成步驟1后，取所述6孔板，每孔加入100yL用pH7. 4的PBS緩沖液配制的 系列濃度的藥物溶液（藥物的加入形式分別為：鹽酸表阿霉素、脂質(zhì)體A2、脂質(zhì)體B1、脂質(zhì) 體C1或脂質(zhì)體D1，使各試驗(yàn)組鹽酸表阿霉素的濃度為5yg/ml;設(shè)置用等體積PBS緩沖液 代替藥物溶液的空白對照），置于37°C、5%C02條件下培養(yǎng)48小時(shí)。
[0124] 3、完成步驟2后，取所述6孔板，吸棄培養(yǎng)上清，用冷的pH7. 4的PBS緩沖液漂洗， 然后用不含H)TA的胰酶消化，再用pH7. 4的PBS緩沖液洗滌細(xì)胞兩次，然后用300yLpH7. 4 的PBS緩沖液將細(xì)胞吹勻，之后依次加入500yL的BindingBuffer、5yLAnnexinV-APC、 5yL7-AAD，混勻后于室溫避光的條件下反應(yīng)lOmin，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測。
[0125] 進(jìn)行三個(gè)重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果取平均值。
[0126] 結(jié)果見圖6仏為脂質(zhì)體42，13為脂質(zhì)體81，（3為脂質(zhì)體(：1，(1為脂質(zhì)體01，6為鹽 酸表阿霉素，f為空白對照）。在藥物濃度和藥物孵育時(shí)間相同的條件下，誘導(dǎo)C6大鼠腦膠 質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的百分比由高到低的順序依次如下：脂質(zhì)體Dl>脂質(zhì)體Cl>脂質(zhì)體Bl>脂質(zhì) 體A2>游離表阿霉素〉空白對照。Q4-4所占百分比依次為49. 9±0. 19%、47. 4±0. 23%、 38. 2±0. 41%、29. 5±0. 26%、10. 7±0. 29%和 0? 5±0. 06%。結(jié)果表明，MAN和WGA共同修 飾的雙重靶向復(fù)方脂質(zhì)體D1與其他制劑組相比，具有更強(qiáng)的誘導(dǎo)C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的 作用。
[0127] 實(shí)施例6、C6大鼠腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞球?qū)嶒?yàn)
[0128] 1、取96孔板，每孔加入40y1含2g/100ml瓊脂糖的無血清DMEM培養(yǎng)液。
[0129] 2、完成步驟1后，取所述96孔板，每孔接種150ylC6大鼠腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞（2000 個(gè)細(xì)胞/孔），置于37°C、5%C02條件下培養(yǎng)24小時(shí)。
[0130] 3、完成步驟2后，取所述96孔板，每孔加入20yL用無血清DMEM培養(yǎng)液配制的 藥物溶液（藥物的加入形式分別為：鹽酸表阿霉素、脂質(zhì)體A1、脂質(zhì)體A2、脂質(zhì)體B1、脂質(zhì) 體C1或脂質(zhì)體D1，使各試驗(yàn)組鹽酸表阿霉素的濃度為4yM;設(shè)置用等體積無血清DMEM培 養(yǎng)液代替藥物溶液的空白對照），置于37°C、5%C02條件下培養(yǎng)，分別于給藥前，給藥后第1 天、第2天、第3天和第5天在倒置顯微鏡下觀察腫瘤球的形態(tài)、球核是否有壞死，用目鏡測 微尺測量腫瘤球的長徑和短徑，計(jì)算腫瘤球體積。
[0131]V=(JrXdmaxXdmin) /6；
[0132]V是腫瘤球體積，dmax是腫瘤球長徑，dmin是腫瘤球短徑。
[0133]R=(Vdayi/Vday0)X100%；
[0134]R是腫瘤球體積率，Vdayi是給藥后第i天的C6大鼠腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞腫瘤球體積， Vday0是給藥前C6大鼠腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞腫瘤球的體積。
[0135] 進(jìn)行三個(gè)重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果取平均值。
[0136] 結(jié)果見圖7 (1為空白對照，2為鹽酸表阿霉素，3為脂質(zhì)體A1，4為脂質(zhì)體A2, 5為 脂質(zhì)體Bl，6為脂質(zhì)體Cl，7為脂質(zhì)體D1)。脂質(zhì)體D1處理組C6大鼠腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞球在大 小和體積上較其他組相比，產(chǎn)生顯著性的減小。第5天時(shí)的C6大鼠腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞球體積變 化率：空白對照組為2. 56±0. 47,游離表阿霉素為0. 61 ±0. 09,脂質(zhì)體A1為0. 64±0. 12， 脂質(zhì)體A2為0. 62±0. 08,脂質(zhì)體B1為0. 61 ±0. 07,脂質(zhì)體C1為0. 57±0. 31，脂質(zhì)體D1為 0. 46±0. 33。結(jié)果說明雙配體修飾的脂質(zhì)體更能有效的抑制細(xì)胞球的生長。
[0137] 實(shí)施例7、脂質(zhì)體體外雙重靶向作用評(píng)價(jià)
[0138] 一、體外血腦屏障模型評(píng)價(jià)
[0139] 1、血腦屏障體外模型跨膜電阻的測定
[0140]將bEnd. 3細(xì)胞接種在插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿的上池（5X104個(gè)細(xì)胞/孔），上池加入 500y1DMEM培養(yǎng)液，下池加入1350y1DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)4天（每兩天更換一次培養(yǎng)液）。 通過測定單層血腦屏障（BBB)的電阻來判斷BBB形成的緊密程度，電阻值高于150Qcm2 (扣 除本底后）可用于實(shí)驗(yàn)，血腦屏障體外模型的跨膜電阻（TEER)為163-181Qcm2。
[0141] 2、HRP含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
[0142] 用無血清的DMEM作為溶劑，配制濃度為12. 5ng/ml、6. 25ng/ml、3. 125ng/ml、 1. 56ng/ml、0. 78ng/ml和0. 39ng/ml的辣根過氧化物酶系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。取96孔板，每孔加 入50y1標(biāo)準(zhǔn)溶液，再加入90y1TMB顯色液，孵育15min后加入50y1終止液（lmol/L H2S04)，置于酶標(biāo)儀中于450nm波長下測定吸光度，建立HRP含量標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖8)。
[0143] 3、BBB通透性測定
[0144] (1)將bEnd. 3細(xì)胞接種在插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿的上池（5X104個(gè)細(xì)胞/孔），上池 加入500y1DMEM培養(yǎng)液，下池加入1350y1DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)。
[0145] (2)當(dāng)步驟（1)進(jìn)行到TEER值大于150Q時(shí)，吸棄上池和下池的培養(yǎng)液，向上池加 入500y1含500ngHRP的DMEM完全培養(yǎng)基，向下池加入1350y1完全DMEM培養(yǎng)基，分別 于0. 5、1、2、4、8、12、24小時(shí)后時(shí)從下池中取出50y1液體檢測HRP濃度，同時(shí)向下池補(bǔ)加 50ylDMEM完全培養(yǎng)基。
[0146] 通透率，=Ct下池/C。上池X100%;
[0147]CtT_:t時(shí)刻下池中HRP的濃度，C實(shí)驗(yàn)開始時(shí)上池中HRP的濃度（lOOOng/ ml)〇
[0148] 不同時(shí)間的HRP通透率測定結(jié)果見圖9。體外BBB模型建成后，24小時(shí)內(nèi)的通透 率HRP小于7%，說明模型的致密性良好，符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。
[0149] 二、不同脂質(zhì)體制劑透過血腦屏障能力的測定
[0150] 1、將bEnd. 3細(xì)胞接種在插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿的上池（5X104個(gè)細(xì)胞/孔），上池加 入500y1DMEM培養(yǎng)液，下池加入1350y1DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)。
[0151] 2、當(dāng)步驟1進(jìn)行到TEER值大于150Q時(shí)，吸棄上池和下池的培養(yǎng)液。
[0152] 3、完成步驟2后，第一組向上池加入500yl無血清DMEM培養(yǎng)基（作為空白對 照），第二組向上池加入500y1含5yg鹽酸表阿霉素的無血清DMEM培養(yǎng)基，第三組向上 池加入500y1含脂質(zhì)體A1 (含5yg鹽酸表阿霉素）的無血清DMEM培養(yǎng)基，第四組向上 池加入500y1含脂質(zhì)體A2 (含5yg鹽酸表阿霉素）的無血清DMEM培養(yǎng)基，第五組向上池 加入500y1含脂質(zhì)體B1 (含5yg鹽酸表阿霉素）的無血清DMEM培養(yǎng)基，第六組向上池加 入500y1含脂質(zhì)體C1 (含5yg鹽酸表阿霉素）的無血清DMEM培養(yǎng)基，第七組向上池加 入500y1含脂質(zhì)體D1 (含5yg鹽酸表阿霉素）的無血清DMEM培養(yǎng)基，各組均向下池加入 1000y1無血清DMEM培養(yǎng)基。
[0153] 4、完成步驟3后，繼續(xù)培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)2小時(shí)、4小時(shí)、8小時(shí)和24小時(shí)后從下池 取出0. 5ml液體檢測鹽酸表阿霉素濃度，同時(shí)向下池補(bǔ)加0. 5mlDMEM完全培養(yǎng)基。
[0154] 鹽酸表阿霉素跨體外血腦屏障轉(zhuǎn)運(yùn)率=Ct下池/C。上池X100%;
[0155] CtT_:t時(shí)刻下池中鹽酸表阿霉素的濃度，實(shí)驗(yàn)開始時(shí)上池中鹽酸表阿霉素 的濃度（10yg/ml)。
[0156] 進(jìn)行三個(gè)重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果取平均值。
[0157] 鹽酸表阿霉素跨體外血腦屏障轉(zhuǎn)運(yùn)率結(jié)果見圖10。脂質(zhì)體D1在體外血腦屏障模 型上的轉(zhuǎn)運(yùn)率高于其它脂質(zhì)體，并且隨著轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間的延長，優(yōu)勢愈加明顯。
[0158] 三、MAN競爭實(shí)驗(yàn)
[0159] 1、將bEnd. 3細(xì)胞接種在插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿的上池（5X104個(gè)細(xì)胞/孔），上池加 入500y1DMEM培養(yǎng)液，下池加入1350y1DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)。
[0160] 2、當(dāng)步驟1進(jìn)行到TEER值大于150Q時(shí)，向上池加入200ygMAN，30min后吸棄上 池和下池的培養(yǎng)液。
[0161] 3、完成步驟2后，第一組向上池加入500y1含脂質(zhì)體B1 (含5yg鹽酸表阿霉素） 的無血清DMEM培養(yǎng)基，第二組向上池加入500y1含脂質(zhì)體D1 (含5yg鹽酸表阿霉素）的 無血清DMEM培養(yǎng)基，各組均向下池加入1000y1無血清DMEM培養(yǎng)基。
[0162] 4、當(dāng)步驟1進(jìn)行到TEER值大于150Q時(shí)，吸棄上池和下池的培養(yǎng)液。
[0163] 5、完成步驟4后，第三組向上池加入500y1含脂質(zhì)體B1 (含5yg鹽酸表阿霉素） 的無血清DMEM培養(yǎng)基，第四組向上池加入500y1含脂質(zhì)體D1 (含5yg鹽酸表阿霉素）的 無血清DMEM培養(yǎng)基，各組均向下池加入1000y1無血清DMEM培養(yǎng)基。
[0164] 6、分別完成步驟3和步驟5后，繼續(xù)培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)2小時(shí)、4小時(shí)、8小時(shí)和24 小時(shí)后從下池取出0. 5ml液體檢測鹽酸表阿霉素濃度，同時(shí)向下池補(bǔ)加0. 5mlDMEM完全培 養(yǎng)基。
[0165] 進(jìn)行三個(gè)重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果取平均值。
[0166]