增強對艾美球蟲的免疫應答或限制艾美球蟲感染的組合物和方法
【專利說明】増強對艾美球蟲的免疫應答或限制艾美球蟲感染的組合物 和方法
[0001] 相關申請的交叉參考
[0002] 本專利申請要求2013年2月14日提交的美國臨時專利申請?zhí)?1/764, 681的優(yōu) 先權權益，該臨時專利申請的全部內容在此通過引用并入此處。
[0003] 序列表
[0004] 本申請是通過EFS-Web電子提交的，并且包含電子提交的txt格式的序列表。該 txt文件包含題目為"2014-02-13_5658-00201_ST25. txt"的序列表，其創(chuàng)建于2014年2月 13日，大小是40. 3千字節(jié)。這個txt文件中包含的序列表是說明書的一部分，因此通過引 用其全部并入此處。
技術領域
[0005] 球蟲病（coccidiosis)是由頂復門（apicomplexan)原生動物寄生蟲（艾美球 蟲屬（Eimeria spp.)和相關寄生蟲）引起的禽、豬和牲畜的傳染性疾病，是世界范圍的 難題。由于球蟲病對禽業(yè)估計高達每年二十億美元生產損失的經(jīng)濟影響，球蟲病是禽的 前十大傳染性疾病。其它頂復門寄生蟲也引起疾病，包括瘧原蟲（Plasmodium)、隱孢子蟲 (Cryptosporidium)和弓形蟲（Toxoplasma)，其分別是皰疾、隱孢子蟲病和弓形蟲病的病 原體。
【背景技術】
[0006] 球蟲病的典型癥狀包括食欲的迅速喪失、體重減輕、腹瀉和急劇的死亡率。當群體 暴露于高水平病原體時以及在大多數(shù)情況下易感染球蟲病的鳥暴露于繼發(fā)性細菌感染時， 在群體中爆發(fā)球蟲病。傳統(tǒng)的疾病控制方法包括施用抗生素和化學治療試劑。然而，隨著 持續(xù)使用，這引發(fā)耐藥性問題。使用抗生素也降低社會對禽肉的接受度。因為接種疫苗能 夠賦予長期保護（通常是商用雞的整個生命周期），所以接種疫苗是合理的方法。
[0007] 針對艾美球蟲的大多數(shù)商業(yè)上可獲得的疫苗，基于控制的低劑量的基本上完全毒 力的但對藥物敏感的艾美球蟲寄生蟲。使用目前基于艾美球蟲的疫苗進行接種疫苗，在接 種的群體中產生大量疫苗反應發(fā)病率和經(jīng)濟損失。因此，需要針對艾美球蟲的有效的低毒 力疫苗。基于保守的免疫原性靶標的針對艾美球蟲的有效疫苗，也可能被證明可用作針對 其它頂復門寄生蟲的疫苗。

【發(fā)明內容】

[0008] 此處提供一種包含編碼頂復門菱狀體（Apicomplexan Rhomboid)多肽的第一多核 苷酸序列的疫苗載體，及其使用方法。
[0009] 在一方面，公開了一種疫苗載體，其含有編碼頂復門菱狀體多肽或其免疫原性片 段的第一多核苷酸和編碼免疫刺激性多肽的第二多肽序列。合適地，頂復門菱狀體多肽和 免疫刺激性多肽表達在疫苗載體的表面。頂復門菱狀體多肽可包含SEQ ID NO: 1，SEQ ID N0:2，SEQ ID N0:3，SEQ ID N0:4，SEQ ID N0:37，SEQ ID N0:38，SEQ ID N0:l-4、37-38 的 至少一個的免疫原性片段，或SEQ ID NO: 1-4和37-38的組合。免疫刺激性多肽可以是能 夠結合⑶40的⑶154多肽或HMGBl多肽。所述⑶154多肽包含不多于50個氨基酸，以及 包含⑶154的氨基酸140-149或其同源物。
[0010] 在另一方面，疫苗載體包含第一多核苷酸，其編碼SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:37、SEQ ID N0:38 的頂復門菱狀體多肽、SEQ ID N0:l-4 或37-38的至少一個或SEQ ID NO: 1-4或37-38的組合的免疫原性片段。頂復門菱狀體多 肽可表達在疫苗載體的表面。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明的疫苗載體可以是病毒、酵母、細菌或脂質體載體。藥物組合物可包含 此處所述的疫苗載體以及藥學上可接受的載體。
[0012] 在另一方面，提供了通過向受試者施用此處所述的疫苗載體來增強受試者中針對 頂復門寄生蟲的免疫應答的方法。增強的免疫應答可以是增強的抗體應答、增強的T細胞 應答或其組合。
[0013] 在又一方面，提供了通過向受試者施用此處所述的疫苗載體來減少受試者中與頂 復門寄生蟲感染相關的發(fā)病率和死亡率的方法。與對照相比，在施用疫苗載體的受試者中， 疫苗載體能夠減少與頂復門寄生蟲繼發(fā)感染相關的發(fā)病率和死亡率。
【附圖說明】
[0014] 圖1是顯示在若干頂復門寄生蟲之間的MPP序列同源性的概要圖。在頂復門中一 致的MPP序列在氨基酸序列上是高度相似的。在一致序列中不相同的位置以X表示，其顯 示在圖頂行并且是SEQ ID NO: 38。剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii)序列（在一致序列之 下的頭四行）與來自巨型艾美球蟲（Eimeria maxima)的MPP序列SEQ ID NO: 2具有100% 同一,性。底部兩個序列分別是來自犬新孢子蟲（Neospora caninum) (SEQ ID NO:3)和柔嫩 艾美球蟲（Eimeria tenella) (SEQ ID N0:4)的同源物。
[0015] 圖2是在實施例中所述的疫苗載體構建體的概要表示。
[0016] 圖3是柱狀圖，表示使用表達所述序列的所述疫苗載體接種小雞后再使用巨型艾 美球蟲感染后8天的小雞的體重（克）。通過不同的字母表示在處理組之間的顯著差異 (p〈0. 05)。
[0017] 圖4是柱狀圖，表示使用表達所述序列的所述疫苗載體接種小雞后再使用巨型艾 美球蟲挑戰(zhàn)感染后29天存活的小雞的體重（克）。通過實際的p值和星號（*)表示在處理 組之間的顯著差異（P〈〇. 05)。
[0018] 圖5是柱狀圖，表示使用表達所述序列的所述疫苗載體接種后，使用巨型艾美球 蟲挑戰(zhàn)感染后8天，與巨型艾美球蟲致命性挑戰(zhàn)感染相關的死亡率百分比。通過星號（*) 表不顯著差異（p〈0. 05)。
【具體實施方式】
[0019] 針對球蟲病的傳統(tǒng)疫苗通常是基于可控數(shù)目傳代（deliver)的活的/減毒的寄生 蟲。然而，由于寄生蟲是活的以及能夠引起疾病，所以感染的風險不能消除。此外，這些類 型疫苗的生產成本非常高，因為它涉及到通過活的鳥來傳遞寄生蟲、定期收集和確保從生 產到在孵化場或在農場使用的不中斷的冷中轉鏈。使用接種疫苗是關鍵的控制方法，使用 重組疫苗可改進基于球蟲病疫苗的整體效率同時降低生產成本。
[0020] 艾美球蟲物種是高度免疫原性的、并且能夠刺激強效的宿主免疫應答。這種真核 生物部分的廣泛抗原庫（repertoire)在功能上是高度特異性的，因而適合作為重組疫苗 開發(fā)的合適靶標。子孢子和裂殖子是寄生蟲的最能動（motile)階段以及負責激活和維持 活性感染。這些進入腸上皮細胞的侵入階段是寄生蟲在宿主細胞內繼續(xù)其生命周期的必要 過程。位于寄生蟲的前（頂）端的高度特化的細胞器組參與運輸這些能動階段從腸腔易位 進入上皮層所需的各種蛋白。這種頂端復合物由包括大量微線體（microneme)的各種分泌 細胞器組成，所述微線體將蛋白環(huán)境轉運至能動的頂復門生殖子（zoite)表面以支持能動 性（motility)的基本功能。
[0021] 在幾個詳細描述的微線體相關蛋白中，血小板反應相關的黏著蛋白（TRAP)已在 作為候選疫苗的重組沙門氏菌屬（Salmonella)和芽孢桿菌屬（Bacillus)載體系統(tǒng)中用作 成功的重組抗原。參見美國公開號2011/0111015,其通過引入全部內容并入此處。許多微 線體蛋白具有類似的行為模式，因為當子孢子靠近宿主細胞時，微線體從子孢子的前端的 微線體復合物中釋放，并且作為寄生蟲和其所在基質之間的連接。然后，微線體蛋白穿過寄 生蟲的表面向后移位，從而將寄生蟲移動至接近宿主細胞。這滑行運動形式是所有頂復門 寄生蟲典型的。當微線體蛋白已被易位到寄生蟲的后端，它需要被切割并且從寄生蟲的表 面釋放以便成功地完成入侵過程。在寄生蟲細胞膜內或細胞膜上組成型表達的蛋白酶家族 來執(zhí)行此功能。切割過程發(fā)生在細胞內并且是用于傳播感染所必須的。
[0022] 重組疫苗設計的新方法包括靶向這種蛋白酶和干擾切割/入侵過程。參與切割過 程的蛋白酶家族稱為菱狀體蛋白酶，并且非常詳細地描述在與艾美球蟲和其它頂復門同源 的弓形蟲（Toxoplasma)物種中。菱狀體蛋白酶（R0M4和R0M5, MPP)主要參與微線體蛋白 的切割，并且在不同的頂復門寄生蟲中具有良好的同源性。我們的假說是基于這樣前提，如 果我們能夠免疫地靶向蛋白酶，抗體結合會干擾切割過程從而削弱子孢子/裂殖子運動性 (mobility)。為進行成功感染，寄生蟲的細胞內發(fā)育是關鍵，而我們的方法可以縮短細胞侵 入因此干擾生命周期的建立。靶向MPP的一個優(yōu)點是，這種蛋白質在許多頂復門物種間的 保守性質使其不僅是艾美球蟲還是其它頂復門的合適靶標。
[0023] 對預測的MPP抗原性區(qū)（R0M5)進行比對，并檢查在六種不同的頂復門之間的 同源性（圖1)。所比較的七個序列如下：柔嫩艾美球蟲R〇M4(JN558353)、剛地弓形蟲 ME49R0M5 (XP_002370238)、剛地弓形蟲 R0M5 (AAT84606)、剛地弓形蟲 R0M5 (AY587208)、剛 地弓形蟲RH R0M5(AM055942)、剛地弓形蟲（AY634626)和來自SEQ ID N0:2的巨型艾美 球蟲的MPP插入。適當?shù)捻攺烷T寄生蟲包括但不限于：艾美球蟲物種，包括但不限于柔嫩 艾美球蟲、巨型艾美球蟲、和布氏艾美球蟲（Eimeria brunetti);剛地弓形蟲；犬新孢子 蟲；隱孢子蟲物種；和皰原蟲物種，包括但不限于惡性皰原蟲（Plasmodium falciparum)、 三日癥原蟲（Plasmodium malariae)、諾氏癥原蟲（Plasmodium knowlesi)、和間日癥原蟲 (Plasmodium vivax)〇
[0024] 重組DNA技術能相對容易地操作許多酵母、細菌及病毒物種。一些微生物是輕度 致病性或無致病性，卻能夠產生強烈的免疫應答。對于激發(fā)針對在載體中重組表達的抗原 的免疫應答而言，這些微生物成為有吸引力的疫苗載體。微生物所承載的疫苗能夠模擬自 然感染，有助于產生強烈的和持久的粘膜免疫性，并且生產和施用相對廉價。此外，這樣的 載體可經(jīng)常攜帶一個以上的抗原，而且有能力提供保護免受多種傳染性試劑。
[0025] 在一方面，提供了包含編碼SEQ ID NO: 1-4、37-38的頂復門菱狀體多肽、其免疫原 性片段或其組合的第一多核苷酸序列的疫苗載體。在另一實施方案中，提供可包括編碼頂 復門菱狀體多肽的第一多核苷酸和編碼免疫刺激性多肽的第二多核苷酸的疫苗載體。菱狀 體多肽和任選的免疫刺激性多肽表達在疫苗載體的表面。菱狀體多肽可包含全長蛋白（SEQ ID NO: 39)或免疫原性片段，例如SEQ ID NO: 1-4和37-38所提供的那些。例如，菱狀體多 肽可包括、可基本上由或可由 SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:37、SEQ ID N0:38或這些SEQ ID NO中任一個的免疫原性片段組成。這些片段的組 合也可用在疫苗載