體上。疫苗載體可包括SEQ ID NO: 1-4或37-38。單一疫苗載體也還可 包括單一片段的多個拷貝。
[0026] 菱狀體多肽的免疫原性片段可以是至少5、6、7、8、10、12、14、16，18或20個氨基 酸長，并且與此處提供的SEQ ID NO: 1-4或37-38的片段具有至少85%、90%、92%、94%、 95 %、96 %、97 %、98 %或99 %的百分比同一性的序列。不受理論的限制，此處提供的疫苗 載體被認(rèn)為通過誘導(dǎo)能夠阻斷寄生蟲侵入細(xì)胞的抗體應(yīng)答，從而減少與艾美球蟲感染相關(guān) 的發(fā)病率和死亡率。本領(lǐng)域技術(shù)人員明白B細(xì)胞表位通常性質(zhì)上是親水性，從而此信息可 以用來產(chǎn)生針對此處提供的SEQ ID NO :1-4和37-38多肽的免疫原性片段。SEQ ID NO :2 的親水性圖譜（plot)表示肽的三個親水區(qū)和三個潛在的B細(xì)胞表位，包括SEQ ID NO :2的 氨基酸1-11、18-27和31-43。這些氨基酸的片段對應(yīng)于SEQ ID NO :3和37的氨基酸7-16 以及SEQ ID N0:4的氨基酸12-21。如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :38的兩個一致序列所 示，與SEQ ID NO :2的18-27相對應(yīng)的氨基酸是在物種間和頂復(fù)門寄生蟲屬中高度保守的。 針對這樣高度保守表位的免疫應(yīng)答可以允許從單一疫苗引發(fā)跨物種或甚至跨屬的免疫。
[0027] -種疫苗包含含有編碼抗原性多肽的多核苷酸的任何組合物，其中抗原性多肽能 夠激發(fā)對多肽的免疫應(yīng)答。疫苗載體是可被工程化以攜帶抗原或免疫刺激性多肽的組合 物，并且還可以包含佐劑、或與佐劑一起施用以進(jìn)一步增強(qiáng)對寄生蟲的免疫應(yīng)答，并提供更 好的保護(hù)免受繼發(fā)感染相關(guān)的發(fā)病率和死亡率。此處公開了載體如細(xì)菌載體用于接種疫苗 和產(chǎn)生對艾美球蟲或其它頂復(fù)門寄生蟲，如瘧原蟲（瘧疾的病原體）、弓形蟲和隱孢子蟲的 免疫應(yīng)答的用途。施用疫苗載體后的免疫應(yīng)答不需要是完全保護(hù)性的，但可降低繼發(fā)感染 相關(guān)的發(fā)病率或百分比死亡率（即，死亡的概率）。
[0028] 編碼SEQ ID NO: 1-4、37-38的菱狀體多肽抗原或其片段的多核苷酸、以及編碼來 自任何數(shù)目的致病性生物的其它抗原的多核苷酸可插入到載體中并在載體中表達(dá)。載體表 達(dá)這些多核苷酸將允許在免疫受試者之后產(chǎn)生抗原性多肽。多核苷酸可以插入到載體的染 色體中或者在質(zhì)?；蚱渌旧w外DNA上編碼。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，存在多種用于在 載體（如沙門氏菌屬或芽孢桿菌屬）中獲得多核苷酸表達(dá)的方法。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已 知的方法，多核苷酸可以可操作地連接到啟動子（例如，組成型啟動子、誘導(dǎo)型啟動子等）。 適當(dāng)?shù)?，編碼菱狀體抗原的多核苷酸被插入到載體（如細(xì)菌載體）中從而表達(dá)該多核苷酸。
[0029] 編碼菱狀體抗原的多核苷酸可以符合讀碼框地插入至編碼跨膜蛋白的多核苷酸 中。編碼菱狀體抗原的多核苷酸插入到載體多核苷酸序列中，以允許在載體的表面上表達(dá) 菱狀體抗原。例如，編碼菱狀體抗原的多核苷酸可以符合讀碼框地被插入在載體多核苷酸 的編碼跨膜蛋白外環(huán)區(qū)的區(qū)域中，以使得載體的多核苷酸序列保持在讀碼框中。在一個實 施方式中，編碼菱狀體多肽的第一多核苷酸可插入到沙門氏菌IamB基因的環(huán)9中。
[0030] 在另一個實施方式中，第一多核苷酸插入或者在蛋白的表面露出端，所述蛋白附 著至細(xì)胞壁但不是跨膜蛋白。所述蛋白可以是通過蛋白或脂質(zhì)錨而錨定或附著至細(xì)胞壁的 分泌蛋白。在實施例中，MPP(SEQ ID N0:2)多肽插入枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis) 纖連蛋白結(jié)合蛋白（FbpB)的3'端?；蛘?，編碼菱狀體抗原的第一多核苷酸可插入編碼分 泌多肽的多核苷酸。
[0031] 本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，編碼菱狀體抗原的多核苷酸可插入各種載體多核苷酸 中，以提供菱狀體抗原的表達(dá)并遞呈至使用疫苗治療的受試者的免疫細(xì)胞?？砂瑔慰截?或一個以上拷貝的編碼菱狀體抗原的多核苷酸。多個拷貝可插入在單個位置或一個以上位 置?；蛘?，多表位例如菱狀體抗原的組合（在此處提供為SEQ ID NO: 1-4和37-38)、或這種 表位與其它頂復(fù)門表位（如TRAP)或來自其它病原體的表位的組合，可插入在載體的相同 位置或一個以上位置。
[0032] 適當(dāng)?shù)?，第一多核苷酸編碼菱狀體多肽的部分、完整的菱狀體多肽或來自菱狀體 多肽的一個以上的表位。尤其考慮來自單一寄生蟲或病原體的一個以上多肽的表位的組 合、或者來自相關(guān)病原體的表位的組合。多核苷酸可以插入到載體中，以及可作為包含一個 以上表位的融合蛋白插入。在實施例中，SEQ ID N0:2和15(MPP-HMGB1)或SEQ ID N0:2、 40和15(MPP-TRAP-HMGB1)并入芽孢桿菌屬的載體。適當(dāng)?shù)?，插入至載體的菱狀體多肽的部 分是抗原性片段?？乖云问悄軌蚣ぐl(fā)細(xì)胞或體液免疫應(yīng)答或者能夠降低寄生蟲繼發(fā)感 染相關(guān)的發(fā)病率或死亡率的肽或多肽。
[0033] 抗原性多肽或表位包含任何免疫原性的多肽。抗原性多肽包括但不限于病原體相 關(guān)、過敏原相關(guān)、腫瘤相關(guān)或疾病相關(guān)的抗原。病原體包括病毒、寄生蟲、真菌和細(xì)菌病原體 以及蛋白病原體如朊病毒?？乖远嚯目梢允侨L蛋白或其部分。已知許多蛋白的免疫系 統(tǒng)識別是基于通常稱為表位的相對少量的氨基酸。表位可以是僅4-8個氨基酸長。因此， 此處所述的抗原多肽可以是全長蛋白、4個氨基酸長的表位或這些端之間的任何部分。事 實上，抗原性多肽可包含來自單一病原體或蛋白的一個以上的表位?？乖远嚯呐c此處所 提供的 SEQ ID NO 具有至少 85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的百分比 同一性。適當(dāng)?shù)?，菱狀體抗原或多肽的抗原性片段可以是全長蛋白序列的四、五、六、七、八、 九、10個或更多個氨基酸、15個或更多個氨基酸、或者20個或更多個氨基酸。
[0034] 相同表位的多個拷貝或來自相同或不同蛋白的多個表位可以包括在疫苗載體中。 疫苗載體中的表位可以是相關(guān)且同源的，從而允許用單一疫苗載體靶向多個相關(guān)病原體。 可以想象，來自相同或不同病原體或疾病的幾個表位或抗原可以以單一疫苗載體組合進(jìn)行 施用以產(chǎn)生針對多種抗原的增強(qiáng)的免疫應(yīng)答。重組疫苗載體可以編碼來自多個病原性微生 物、病毒或腫瘤相關(guān)抗原的抗原。施用能夠表達(dá)多種抗原的疫苗載體具有以下優(yōu)點：同時誘 導(dǎo)針對兩種或更多種疾病的免疫、提供針對單一病原體多個株的更廣泛保護(hù)或者針對單一 病原體更強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答。
[0035] 在實施例中，MPP抗原（SEQ ID NO:2)與第二抗原性多肽共表達(dá)在若干載體中。來 自巨型艾美球蟲高分子量、無性階段抗原（EmTFP250)被證明是通過飼養(yǎng)這種原生寄生蟲 感染的母雞所產(chǎn)生的母源抗體的靶。分析這種抗原的氨基酸序列揭示TRAP (血小板反應(yīng)蛋 白相關(guān)的匿名蛋白）家族的新成員，含有16個血小板反應(yīng)蛋白1型重復(fù)和31個表皮生長 因子樣鈣結(jié)合結(jié)構(gòu)域。見美國專利公開號2011/0111015。EmTFP250或TRAP還包含兩個低 復(fù)雜度（complex)、富含谷氨酸及甘氨酸殘基的親水區(qū)，以及與寄生蟲滑行運(yùn)動相關(guān)的跨膜 結(jié)構(gòu)域/胞質(zhì)的尾，其在頂復(fù)門微線體蛋白中是高度保守的。選擇幾個潛在的表位并鑒定 為美國專利公開號2011/0111015的SEQ ID NO :1-3和11，其在此再現(xiàn)為SEQ ID NO :5-8。 在此處所提供的實施例中使用SEQ ID NO :40,其也稱為TRAP抗原。SEQ ID NO :40和SEQ ID NO :6之間有單個氨基酸變化。在SEQ ID NO :6的位置6的脯氨酸變?yōu)樵赟EQ ID NO : 40的相同位置6的精氨酸。進(jìn)行這種改變是為了使表位更具柔性（flexible)和親水性以 實現(xiàn)將其制備成更好抗原的目標(biāo)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可進(jìn)行其它單氨基酸改變以在本發(fā)明 的范圍內(nèi)改善抗原性。由于這種抗原的保守性，通過載體表達(dá)這些表位可誘導(dǎo)免受多個頂 復(fù)門寄生蟲的保護(hù)性免疫，并且施用包含兩個不同抗原性多肽的疫苗載體可誘導(dǎo)更強(qiáng)烈的 免疫反應(yīng)。
[0036] 本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，來自其它病原體的抗原性多肽可用在疫苗載體中以便通 過單一疫苗來增強(qiáng)對一種以上病原體的免疫應(yīng)答。施用針對多種病原體的單一疫苗將是有 利的?？紤]能夠激發(fā)對頂復(fù)門寄生蟲（如艾美球蟲）以及與流感、沙門氏菌屬、彎曲桿菌屬 或其它病原體的組合的免疫應(yīng)答的疫苗。
[0037] 例如，第二抗原性多肽可以是流感多肽，適當(dāng)?shù)厮橇鞲蠬5N1多肽或與流感病毒 的多個株相關(guān)的多肽，如流感M2蛋白的多肽。A型流感病毒M2蛋白的胞外域稱為M2e，突出 于病毒的表面上。M2蛋白的M2e部分包含大約24個氨基酸。在流感中M2e多肽在一種分離 株和另一種之間變化很小。事實上，自1918年流感爆發(fā)以來，從受感染的人當(dāng)中僅分離出 M2e中的幾個自然發(fā)生的突變。此外，從禽和豬宿主分離出來的流感病毒含有不同卻依然保 守的M2e序列。分離自人類、禽和豬宿主的M2e多肽序列的綜述，參見Liu等人Microbes and Infection 7:171-177(2005)和 Reid 等人 J. Virol. 76:10717-10723 (2002)，其中每個 通過引用全部內(nèi)容并入此處。適當(dāng)?shù)兀蓪⒄麄€M2e多肽插入疫苗載體，或僅使用部分。將8 氨基酸多肽（具有氨基酸序列EVETPIRN的LM2(SEQ ID勵:9)，或具有氨基酸序列￡￥￡了?丁尺~ 的其變體M2eA(SEQ ID NO: 10))并入疫苗載體，并證明將其施用到雞之后產(chǎn)生抗體應(yīng)答。參 見美國公開號2011/0027309,通過引用其全部并入此處。
[0038] 并入A型流感疫苗載體內(nèi)的其它適當(dāng)表位包括但不限于A型流感的血凝素（HA) 或核蛋白（NP)的多肽。例如，SEQ ID N0:11、SEQ ID N0:12、SEQ ID N0:13 或 SEQ ID NO: 14的肽可包含在疫苗載體中。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，任何這些序列可以和任何其它表位 (包括源自其它病原體或抗原的表位）組合使用。
[0039] 作為疫苗載體一部分而包含的免疫刺激分子能夠潛在地激活免疫系統(tǒng)的一部分， 這對持久保護(hù)或提供佐劑效用是關(guān)鍵的。免疫刺激性多肽可以是能夠刺激初始)或 適應(yīng)性免疫應(yīng)答的多肽。免疫刺激性多肽不是與疫苗載體天然相關(guān)的多肽，而是和脊椎動 物的免疫系統(tǒng)（如待施用疫苗的受試者的免疫系統(tǒng)）天然相關(guān)的多肽。此處描述兩種免疫 刺激性多肽，即CD154和高迀移率族蛋白BI (High Mobility Group Box D(HMGBl)多肽， 但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解可以使用其它免疫刺激性多肽、或者可選擇地將其它免疫刺激 性多肽與此處所述那些組合使用。
[0040] 編碼參與觸發(fā)免疫系統(tǒng)的多肽的其它多核苷酸也可包含在疫苗載體中。多核苷酸 可以編碼已知其刺激效應(yīng)的免疫系統(tǒng)分子，如參與免疫調(diào)節(jié)的白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子、 干擾素、補(bǔ)體、或另一多核苷酸。疫苗也可包括編碼已知刺激免疫應(yīng)答的肽（如此處所述的 CD154或HMGBl多肽）的多核苷酸。
[0041] HMGBl由激活的巨噬細(xì)胞和受損細(xì)胞分泌，以及作為炎癥細(xì)胞因子介導(dǎo)因子影響 固有免疫應(yīng)答。部分HMGBl序列已被包含在實施例所述的疫苗載體中。HMGBl (高迀移率 族蛋白B-1)蛋白是首先鑒定為對DNA結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性至關(guān)重要的DNA結(jié)合蛋白。它是非序 列特異性結(jié)合D