一種新城疫疫苗玉屏風(fēng)多糖免疫增強(qiáng)劑的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于于畜禽免疫領(lǐng)域，提供了一種畜禽免疫佐劑，具體公開(kāi)了一種新城疫 疫苗中藥玉屏風(fēng)多糖免疫增強(qiáng)劑。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著中國(guó)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、畜牧業(yè)快速增長(zhǎng)，動(dòng)物疫病不僅給畜牧業(yè)生產(chǎn)造成巨大的 經(jīng)濟(jì)損失，而且某些人獸共患病，直接威脅著人類(lèi)的生存和發(fā)展?，F(xiàn)在人們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到，機(jī) 體免疫系統(tǒng)的素亂更易發(fā)生感染。但由于化學(xué)藥物有用藥時(shí)間長(zhǎng)、療效持續(xù)時(shí)間短、藥物殘 留、環(huán)境污染等缺點(diǎn)，而且動(dòng)物機(jī)體的免疫應(yīng)答，有著極其復(fù)雜的過(guò)程，多種因素的參與，所 W免疫抑制產(chǎn)生時(shí)，常不是單一的化學(xué)免疫增強(qiáng)劑所能奏效，因此目前特別缺乏高效低毒 的免疫增強(qiáng)劑。而中藥在運(yùn)方面則有比較明顯的特色和優(yōu)勢(shì)。許多中藥及其復(fù)方W整體調(diào) 整、平衡陰陽(yáng)為特點(diǎn)，使機(jī)體達(dá)到和維持免疫穩(wěn)定，具有持續(xù)作用時(shí)間長(zhǎng)、無(wú)殘留、對(duì)動(dòng)物 機(jī)體刺激小等優(yōu)點(diǎn)，所W成為較理想的免疫增強(qiáng)劑。
[0003] 中藥免疫增強(qiáng)劑與疫苗配合使用，能增強(qiáng)動(dòng)物免疫功能，提高動(dòng)物的抗病力和疫 苗的保護(hù)率，因而在預(yù)防和控制動(dòng)物傳染性疾病上有很大的推廣價(jià)值。多糖因?yàn)槠滹@著的 生物活性，己引起人們?cè)谘邪l(fā)上的極大興趣。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的諸多不足，本發(fā)明提供了一種新城疫疫苗中藥玉屏風(fēng)多糖免 疫增強(qiáng)劑，主要采用黃巧、白術(shù)、防風(fēng)按質(zhì)量比3:1: 1，通過(guò)水煎-醇沉法制備而得，其重要 成分為玉屏風(fēng)多糖；采用運(yùn)種免疫增強(qiáng)劑，與疫苗配合使用，能增強(qiáng)動(dòng)物免疫功能，提高動(dòng) 物的抗病力和疫苗的保護(hù)率，因而在預(yù)防和控制動(dòng)物傳染性疾病上有很大的推廣價(jià)值。 陽(yáng)〇化]本發(fā)明的具體技術(shù)方案是：
[0006] -種新城疫疫苗中藥玉屏風(fēng)多糖免疫增強(qiáng)劑，成分為玉屏風(fēng)多糖，所述的玉屏風(fēng) 多糖采用黃巧、白術(shù)、防風(fēng)按質(zhì)量比3:1:1，通過(guò)水煎-醇沉法制備而得；
[0007] 其中所述玉屏風(fēng)多糖是按如下方法提取的： 陽(yáng)00引 W玉屏風(fēng)散lOOOg計(jì)，將黃巧、白術(shù)、防風(fēng)按質(zhì)量比3:1:1配置成lOOOg玉屏風(fēng)散， 加入8倍質(zhì)量的水浸泡30min;之后煮沸比，過(guò)濾后藥渣加入6倍質(zhì)量的水煮沸比，過(guò)濾后 濾渣再次加入6倍質(zhì)量的水煮沸Ih過(guò)濾，合并=次濾液，將濾液加熱濃縮至lOOOmU冷卻后 300化pm離屯、lOmin，除去雜質(zhì)，蒸饋水定容制成1000血；使其終濃度為Ig/mL;
[0009] 之后用一步醇沉法提取，向上述濃縮液中緩慢加入95wt%乙醇使混合液中乙醇的 終濃度達(dá)80wt%，邊加邊攬拌，添加完成后靜置2地，離屯、，取沉淀置于60°C烘干箱干燥，即 得玉屏風(fēng)總多糖一YPF-PStc;
[0010] 為了達(dá)到免疫增強(qiáng)劑的要求，發(fā)明人進(jìn)一步對(duì)上述獲得的玉屏風(fēng)總多 糖一YPF-PSt。進(jìn)行了純化，具體步驟如下：
[0011] 分別取YPF-PSt。500mg溶解于10血蒸饋水中，得到50mg.血1樣品，之后層析柱 (1. 6cmX90cm)，介質(zhì)為Se地adexA-25,流速0. 42血?min1上樣，之后采用分部收集，用 0. 05mol?L心aCl和Imol?L心aCl各400血梯度洗脫，洗脫液經(jīng)透析袋透析去除氯化鋼和 雜質(zhì)即得純化多糖燈PF-PStp)。
[0012] 在獲得上述的玉屏風(fēng)總多糖一YPF-PSt。后，發(fā)明人采用RAMPSh、RAMPStp、各白術(shù)分 級(jí)多糖（RAMPSwe、RAMPS7。。和RAMPSSW作為對(duì)照對(duì)其免疫增強(qiáng)效果進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示玉 屏風(fēng)多糖免疫增強(qiáng)劑能顯著增強(qiáng)新城疫疫苗免疫維雞的血清抗體效價(jià)，促進(jìn)外周淋己細(xì)胞 增殖，促進(jìn)淋己細(xì)胞進(jìn)入S期和G2/M期，提高CD4\CD8叮淋己細(xì)胞亞群的百分率，提高維雞 免疫器官指數(shù)，能顯著提高新城疫疫苗的免疫效果。 陽(yáng)01引同時(shí)發(fā)明人將每個(gè)多糖設(shè)為5個(gè)濃度，分別為2、4、6、8、100mgmL1，在維雞14天 時(shí)，滴鼻點(diǎn)眼新城疫苗，同時(shí)肌肉注射0. 5mL多糖，連續(xù)S天，28天時(shí)加強(qiáng)免疫，在初免后7、 14、21、28天時(shí)抽血測(cè)定抗體效價(jià)，來(lái)確定免疫效果最好的濃度為6mgmLi。所W我們需要 的玉屏風(fēng)免疫增強(qiáng)劑的劑量為6mgmL1X0. 5血X3天。
[0014] 由此確定了玉屏風(fēng)多糖作為新城疫疫苗免疫增強(qiáng)劑時(shí)的具體用量為：每單位劑量 疫苗配合9mg中藥免疫增強(qiáng)劑使用。
[0015] 綜上所述，采用運(yùn)種免疫增強(qiáng)劑，與新城疫疫苗配合使用，能增強(qiáng)動(dòng)物免疫功能， 提高動(dòng)物的抗病力和疫苗的保護(hù)率，因而在預(yù)防和控制動(dòng)物傳染性疾病上有很大的推廣價(jià) 值。
【附圖說(shuō)明】
[0016] 圖1為各種多糖單獨(dú)刺激外周血淋己細(xì)胞最高細(xì)胞增殖率的變化柱狀圖； 陽(yáng)017] 圖2為多糖協(xié)同PHA刺激時(shí)各組的最高淋己細(xì)胞增殖率的變化柱狀圖；
[0018] 圖3為多糖協(xié)同PHA刺激在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)雞淋己細(xì)胞周期分布的變化柱狀圖；
[0019] 圖4為在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)雞淋己細(xì)胞亞群CD4+的影響柱狀圖；
[0020] 圖5為在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)雞淋己細(xì)胞亞群CD8+的影響柱狀圖；
[0021] 圖6為新城疫IV系弱毒苗免疫維雞后血清ND-HI抗體效價(jià)的變化圖（l〇g2,n= 6);
[0022] 圖7為新城疫IV系弱毒苗免疫維雞后各組胸腺指數(shù)的動(dòng)態(tài)變化圖（g.kg1，n= 4)；
[0023] 圖8為新城疫IV系弱毒苗免疫維雞后各組脾臟指數(shù)的動(dòng)態(tài)變化圖（g.kg1，n= 4)；
[0024] 圖9為新城疫IV系弱毒苗免疫維雞后各組法氏囊指數(shù)的動(dòng)態(tài)變化圖（g.kg1，n =4) 陽(yáng)0巧]圖10為新城疫IV系弱毒苗免疫維雞后多糖在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)雞淋己細(xì)胞周期分布 的變化柱狀圖（n= 4); 陽(yáng)0%] 圖11為新城疫IV系弱毒苗免疫維雞后在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)雞淋己細(xì)胞亞群CD4+的 影響柱狀圖；
[0027]圖12為新城疫IV系弱毒苗免疫維雞后在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)雞淋己細(xì)胞亞群CD8+的 影響柱狀圖。
【具體實(shí)施方式】
[0028]W下通過(guò)實(shí)施例形式的【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō) 明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于W下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容 所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
[0029] 實(shí)施例1多糖的制備
[0030] W玉屏風(fēng)散lOOOg計(jì)，將黃巧、白術(shù)、防風(fēng)按質(zhì)量比3:1:1配置成lOOOg玉屏風(fēng)散， 加入8倍質(zhì)量的水浸泡30min;之后煮沸比，過(guò)濾后藥渣加入6倍質(zhì)量的水煮沸比，過(guò)濾后 濾渣再次加入6倍質(zhì)量的水煮沸Ih過(guò)濾，合并=次濾液，將濾液加熱濃縮至lOOOmU冷卻后 3000rpm離屯、lOmin，除去雜質(zhì)，蒸饋水定容制成lOOOmL;用一步醇沉法提取，向上述濃縮液 中緩慢加入95wt%乙醇使混合液中乙醇的終濃度達(dá)80wt%，邊加邊攬拌，添加完成后靜置 2地，離屯、，取沉淀置于60°C烘干箱干燥，即得玉屏風(fēng)總多糖一YPF-PStc。
[0031] 實(shí)施例2多糖的純化
[0032] 分別取YPF-PSt。500mg溶解于10血蒸饋水中，得到50mg.血1樣品，之后層析柱 (1. 6cmX90cm)，介質(zhì)為Se地adexA-25,流速0. 42血?min1上樣，之后采用分部收集，用 0. 05mol?L心aCl和Imol?L心aCl各400血梯度洗脫，洗脫液經(jīng)透析袋透析去除氯化鋼和 雜質(zhì)即得純化多糖燈PF-PStp)。
[0033] 實(shí)施例3體外免疫效果的比較
[0034] 方法：W玉屏風(fēng)多糖為試驗(yàn)材料，WRAMPSt。、RAMPStp、各白術(shù)分級(jí)多糖（RAMPSe。。、 RAMPS,。。和RAMPSSW作為對(duì)照。首先測(cè)定3個(gè)方劑對(duì)外周血淋己細(xì)胞的安全濃度，然后將3 個(gè)方劑用細(xì)胞培養(yǎng)液（RPMI1640)分別稀釋成62. 5、31. 25、15. 625、7. 813、3. 907yg?血1 一共5個(gè)工作濃度，分別加入到培養(yǎng)的雞外周血淋己細(xì)胞中，在酶聯(lián)免疫儀上檢測(cè)570nm處 的吸光值（Ae,。值），作為淋己細(xì)胞增殖的指標(biāo)。并按公式計(jì)算各多糖的最高細(xì)胞增殖率：最 高細(xì)胞增殖率=(多糖組最高A"。值一細(xì)胞對(duì)照組A"。值）/細(xì)胞對(duì)照組A57。值X100 %。 篩選出RAMPSe。。作為對(duì)照方1和RAMPStp作為對(duì)照方2,在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)細(xì) 胞的周期分布W及CD4\CD8+T淋己細(xì)胞亞群的影響。
[0035]結(jié)果：
[0036] (1)多糖單獨(dú)刺激時(shí)各組淋己細(xì)胞增殖的變化
[0037]YPF-PStc和RAMPStp在 15. 625-62. 5yg?血1、YPF-PStp在 7. 813-62. 5yg?血1、 RAMPS,。。在31. 25yg?血1時(shí)的A57。值顯著高于細(xì)胞對(duì)照組（P<0. 05)(表1)，表明它們?cè)?運(yùn)些濃度均能顯著促進(jìn)雞外周血淋己細(xì)胞增殖。 陽(yáng)03引表1多糖單獨(dú)刺激時(shí)各組淋己細(xì)胞增殖的變化（A"。值）
[0039]
W40] 注：同列數(shù)據(jù)標(biāo)注不同字母者差異顯著（P<0. 05) 下同。
[0041] 最高細(xì)胞增殖率：YPF-PStp在31. 25yg?血1時(shí)的細(xì)胞增殖率最高，為31. 148%; 其次為YPF-PSt。在15. 625yg?血1時(shí)，為24. 257%，兩組顯著高于其它多糖組（P<0. 05) (圖1)，表明它們單獨(dú)促進(jìn)外周血淋己細(xì)胞增殖的效果較強(qiáng)。 陽(yáng)0創(chuàng) 似多糖協(xié)同PHA刺激時(shí)淋己細(xì)胞增殖的變化
[0043] YPF-PSt。在15. 625-62. 5yg?血\YPF-PStp在15. 625-31. 25yg?血\RAMPStp在 3. 125yg.ml\RAMPS抑C在7. 813-15. 625yg.ml1的A的。值顯著高于PHA對(duì)照組（P<〇.05)(表2)。表明它們?cè)谶\(yùn)些濃度能協(xié)同PHA促進(jìn)雞外周血淋己細(xì)胞增殖。 W44] 表2白術(shù)多糖協(xié)同PHA刺激時(shí)淋己細(xì)胞增殖的變化（A"。值）
[0045]
[0046] 最高細(xì)胞增殖率：RAMPSe。。在7. 813yg?血1時(shí)的細(xì)胞增殖率最高，為29. 897%， 其次RAMPStp在31. 25yg?血1時(shí)，為22. 159%，兩組顯著高于其它多糖組（P<0. ， YPF-PSt。和YPF-PStp的細(xì)胞增殖率顯著高于RAMPS7。。、RAMPSs。。和RAMPSt。組（P<〇. 05)(圖 2)。表明它們協(xié)同PHA促進(jìn)外周血淋己細(xì)胞增殖的效果較強(qiáng)。
[0047] (3)多糖體外對(duì)雞外周血淋己細(xì)胞周期的影響 W4引在72h之內(nèi)未經(jīng)任何處理的細(xì)胞大部分處于G0/G1期，其變化不明顯。RAMPStp和YPF-PStp處理細(xì)胞48h、7化后，與RAMPSe。。相比較，G0/G1期細(xì)胞的百分比明顯降低，S期 細(xì)胞百分比明顯增多（P<〇. 05)(表3和圖3)。在所有時(shí)間點(diǎn)，與PHA組相比，YPF-PStp和 RAMPStp對(duì)淋己細(xì)胞周期的SPF值、PI值的影響均顯著（P<0. 05)。YPF-PStp和RAMPStp處理 細(xì)胞4化后，與RAMPSeoc相比較，SPF值和PI值顯著升高（P<0. 05)(表4和5)。
[0049]YPF-PStp在作用于淋己細(xì)胞48h時(shí)升高S期細(xì)胞的百分比的效果最顯著，其SPF 值、PI值也均最大，YPF-PStp效果最明顯。
[0050] 表3在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)雞淋己細(xì)胞周期分布的影響（n= 4)
[0051]
[0054]
[0057] (4)CD4叮淋己細(xì)胞亞群的變化
[0058] 在所有時(shí)間點(diǎn)，試驗(yàn)組的CD4+淋己細(xì)胞百分率均顯著高于空白對(duì)照組（P<0. 05)， YPF-PStp和RAMPStp的CD4 +淋己細(xì)胞百分率顯著高于PHA對(duì)照組（P<0. 05) ;YPF-PStp和 RAMPStp處理細(xì)胞4化后，CD4 +淋己細(xì)胞百分率顯著高于