RAMPSe。。對(duì)照組（P<〇. 05)，表明 YPF-PStp可W提高CD4 +淋己細(xì)胞百分率（表6和圖4)。
[0059] 表6在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)雞淋己細(xì)胞亞群CD4+的影響（n= 4)
[0060]
陽(yáng)06U (5)CD8叮淋己細(xì)胞亞群的變化
[0062] 在所有時(shí)間點(diǎn)，試驗(yàn)組的CD8+淋己細(xì)胞百分率均顯著高于空白對(duì)照組（P<0. 05)， 多糖處理細(xì)胞48h、7化后，CD8+淋己細(xì)胞百分率顯著高于PHA對(duì)照組（P<0. 05)，RAMPStp處 理細(xì)胞4化后，CD8+淋己細(xì)胞百分率顯著高于RAMPSe。。對(duì)照組（P<〇. 05)，表明YPF-PStp可 W提高CD8+淋己細(xì)胞百分率（表7和圖5)。
[0063] 表7在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)雞淋己細(xì)胞亞群CD8+的影響（n= 4)
[0064]
[0066] 實(shí)施例4、體內(nèi)對(duì)維雞新城疫疫苗免疫應(yīng)答的比較
[0067] 方法：W玉屏風(fēng)多糖為試驗(yàn)材料，另制備對(duì)照方1 (RAMPSe。。）和對(duì)照方2 (RAMPStp)。 將健康1日齡海蘭褐維公雞210只，隨機(jī)分為6組，除空白對(duì)照組度C組）外均用新城疫 IV系苗免疫，28日齡二免。在首次免疫的同時(shí)，1-3組分別肌肉注射6mg.mL1的YPF-PStp、 RAMPStp和RAMPSeoc0.5血，4組化ev組）口服鹽酸左旋咪挫0.5血（lOmg.kg1)，無佐劑對(duì)照 組（NA組）注射等量生理鹽水。分別于首次免疫后第7、14、21、28d翼靜脈采血檢測(cè)血清HI 抗體效價(jià)，屯、臟采血測(cè)定外周血T淋己細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、CD4\CD8叮淋己細(xì)胞亞群的變 化，處死維雞后稱取胸腺、脾臟和法氏囊的重量，計(jì)算免疫器官指數(shù)。
[0068]結(jié)果：
[0069] (1)血清ND-HI抗體效價(jià)變化 陽(yáng)070]血清ND-HI抗體效價(jià)變化見于表8和圖6。免疫后第7、14山Y(jié)PF-PStp、RAMPStp和RAMPSe。。組的抗體效價(jià)顯著高于無佐劑組（P<0. ;YPF-PStp和RAMPStp組的抗體效價(jià)顯著 高Lev對(duì)照組；YPF-PStp組的抗體效價(jià)最高，其次為RAMPStp組。 陽(yáng)0川免疫后第21、28山Y(jié)PF-PStp、RAMPStp、RAMPSe。。和Lev組的抗體效價(jià)顯著高于無佐 劑組（P<0. ;YPF-PStp、RAMPStp和RAMPSe。。組的抗體效價(jià)顯著高Lev對(duì)照組（P<0. ; YPF-PStp和RAMPStp組的抗體效價(jià)顯著高RAMPSe。。組；YPF-PStp組的抗體效價(jià)最高。 陽(yáng)0巧表8血清ND-HI抗體效價(jià)的變化化0拓，n= 6)
[0073]
[0074] 似外周血T淋己細(xì)胞增殖的變化 陽(yáng)07引免疫后第7、14d，YPF-PStp和RAMPStp組的A57。值均顯著高于Lev對(duì)照組（P<0.0リ。 而RAMPSe。。組的A日7。值與Lev對(duì)照組的差異不顯著（P〉0. 05)。在14山Y(jié)PF-PStp組的A57。 值均顯著高于RAMPSe。。組（P<0. 05)。免疫后第 21、28d，YPF-PStp、RAMPStp和RAMPS日。。組的 As7。值均顯著高于Lev對(duì)照組（P<0. 05)。在21d，YPF斗SW和RAMIESW組的A57。值均顯著高 于RAMPSeoc組；在28山Y(jié)PF-PStp組的A的。值均顯著高于RAMPS6化組（表9)。
[0076]表9外周血T淋己細(xì)胞增殖的變化（A日wvalue，n= 4)
[0077]
[007引 （3)免疫器官指數(shù)的變化
[0079] ①胸腺指數(shù)的變化
[0080] 胸腺指數(shù)的動(dòng)態(tài)變化見表10和圖7。免疫后第7山Y(jié)PF-PStp和RAMPStp組的胸腺 指數(shù)顯著高于Lev對(duì)照組（P<0. 05)。而RAMPSe。。組的胸腺指數(shù)與Lev對(duì)照組的差異不顯著 (P〉0. 05)。在首免后第14山只有YPF-PStp組的胸腺指數(shù)顯著高于Lev對(duì)照組（P<0. 05)。 在28山Y(jié)PF-PStp和RAMPStp組的胸腺指數(shù)顯著高于RAMPSe。。組。 W81] 表10各組胸腺指數(shù)的動(dòng)態(tài)變化（g.kg1，n= 4)
[0082]
[008引②脾臟指數(shù)的變化
[0084] 脾臟指數(shù)的動(dòng)態(tài)變化見表11和圖8。免疫后第7山Y(jié)PF-PStp和RAMPS tp組的脾 臟指數(shù)顯著高于Lev對(duì)照組（P<0. 05)，RAMPSe。。組的胸腺指數(shù)與Lev對(duì)照組的差異不顯著 (P〉0. ，YPF-PStp組的脾臟指數(shù)顯著高于RAMPSe。。組（P<〇. 。免疫后第14、21、28山 YPF-PStp、RAMPStp和RAMPSe。。組的脾臟指數(shù)顯著高于Lev對(duì)照組（P<0. 05)。在14、28山Y(jié)PF-PStp和RAMPStp組的脾臟指數(shù)顯著高于RAMPS日化組。 W85] 表11各組脾臟指數(shù)的動(dòng)態(tài)變化（g.kg1，n= 4)
[0086]
[0087]③法氏囊指數(shù)的變化 陽(yáng)0蝴法氏囊指數(shù)的動(dòng)態(tài)變化見表12和圖9。免疫后第7、14山Y(jié)PF-PStp和RAMPStp組 的法氏囊指數(shù)顯著高于Lev對(duì)照組和RAMPSe。。組（P<0. 05)。而RAMPSe。。組的法氏囊指數(shù)與 Lev對(duì)照組的差異不顯著（P〉0. 05)。
[0089] 免疫后第21、28山Y(jié)PF-PStp、RAMPStp和RAMPS 6。。組的法氏囊指數(shù)顯著高于Lev對(duì) 照組（P<0.。在21山Y(jié)PF-PStp和RAMPS tp組的法氏囊指數(shù)顯著高于RAMPS e。。組；在28山Y(jié)PF-PStp組的法氏囊指數(shù)顯著高于RAMPS e。。組。 W90] 表12各組法氏囊指數(shù)的動(dòng)態(tài)變化（g.kg1，n= 4)
[0091]
[0092] (4)淋己細(xì)胞周期的變化 陽(yáng)09引免疫后維雞淋己細(xì)胞周期的分布見于表13和圖10。免疫后第7、14d，YPF-PStp、RAMPStp和RAMPS e。。組的各周期分布顯著不同于Lev和無佐劑對(duì)照組（P<0. 05);與Lev對(duì) 照組相比較，YPF-PStp和RAMPS tp組G0/G1期細(xì)胞的百分比明顯降低（P<0. 05)，處于S期和 G2/M期的細(xì)胞百分比明顯增多任<0.05)。YPF-PStp和RAMPStp組的各周期分布也顯著不同 于RAMPSe。。組。免疫后21、28山Y(jié)PF-PS tp、RAMPStp和RAMPS 6。。組都可W顯著降低G0/G1期細(xì) 胞的百分比（P<〇. 05)，S期和G2/M期的細(xì)胞百分比明顯增多（P<0. 05)。與AMPSe。。相比較， YPF-PStp和RAMPS W組免疫21d后，YPF-PStp組免疫28d后，G0/G1期細(xì)胞的百分比明顯降 低，S期細(xì)胞百分比明顯增多（P<0. 05)。
[0094] 免疫后所有時(shí)間點(diǎn)，與Lev組相比，YPF-PStp和RAMPStp組對(duì)淋己細(xì)胞周期的SPF 值、PI值的影響均顯著（P<〇.05)。YPF-PStp和RAMPStp組免疫21d后，與RAMPS6。。組相比較，SPF值和PI值明顯升高（P<0.05)(表14和15)。 陽(yáng)0巧]YPF-PStp組免疫21d后，S期細(xì)胞的百分比的升高效果最顯著，其SPF值、PI值也 均最大，效果最明顯。
[0096] 表13在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)雞淋己細(xì)胞周期分布的影響（n=4)
[0097]
[0098]
陽(yáng)10引 妨外周血CD4\CD8+T淋己細(xì)胞亞群的變化
[0104] 免疫后所有時(shí)間點(diǎn)，試驗(yàn)組的CD4+淋己細(xì)胞百分率均顯著高于無佐劑對(duì)照組 (P<0. 05)，YPF-PStp和RAMPStp的CD4 +淋己細(xì)胞百分率顯著高于Lev對(duì)照組（P<0. 05);YPF-PStp組免疫后7、14d，YPF-PStp和RAMPStp組免疫后21、28d，CD4 +淋己細(xì)胞百分率顯著 高于RAMPSe。。對(duì)照組（P<0. 05)，表明YPF-PStp可W提高CD4 +淋己細(xì)胞百分率（表16和圖 11)。
[01化]免疫后所有時(shí)間點(diǎn)，試驗(yàn)組的CD8+淋己細(xì)胞百分率均顯著高于無佐劑對(duì)照組 (P<0. 05)，YPF-PStp和RAMPStp的CD8 +淋己細(xì)胞百分率顯著高于Lev對(duì)照組（P<0. 05); YPF-PStp組免疫后7、14、28d，YPF-PStp和RAMPStp組免疫后21d，CD8 +淋己細(xì)胞百分率顯著 高于RAMPSe。。對(duì)照組（P<0. 05)，表明YPF-PStp可W提高CD8 +淋己細(xì)胞百分率（表16和圖 11)。 陽(yáng)106]表16在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)雞淋己細(xì)胞亞群CD4\CD8+的影響（n= 4) 陽(yáng)107]
[0108] W上結(jié)果表明，玉屏風(fēng)多糖免疫增強(qiáng)劑能顯著增強(qiáng)新城疫疫苗免疫維雞的血清抗 體效價(jià)，促進(jìn)外周淋己細(xì)胞增殖，促進(jìn)淋己細(xì)胞進(jìn)入S期和G2/M期，提高CD4\CD8+T淋己細(xì) 胞亞群的百分率，提高維雞免疫器官指數(shù)，通過運(yùn)些指標(biāo)的檢測(cè)，我們可W看出玉屏風(fēng)多糖 能顯著提高新城疫疫苗的免疫效果。
[0109] 發(fā)明人進(jìn)一步確定玉屏風(fēng)免疫增強(qiáng)劑的劑量為6mg血1X0. 5血X3天；由此確定 了玉屏風(fēng)多糖作為新城疫疫苗免疫增強(qiáng)劑時(shí)的具體用量為：每單位劑量疫苗配合9mg中藥 免疫增強(qiáng)劑使用。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種新城疫疫苗玉屏風(fēng)多糖免疫增強(qiáng)劑，其特征在于：成分為玉屏風(fēng)多糖，所述的 玉屏風(fēng)多糖采用黃芪、白術(shù)、防風(fēng)按質(zhì)量比3:1: 1，通過水煎-醇沉法制備而得； 其中所述玉屏風(fēng)多糖是按如下方法提取的： 以玉屏風(fēng)散1000 g計(jì)，將黃芪、白術(shù)、防風(fēng)按質(zhì)量比3:1:1配置成1000 g玉屏風(fēng)散，加 入8倍質(zhì)量的水浸泡30min ;之后煮沸l(wèi)h，過濾后藥渣加入6倍質(zhì)量的水煮沸l(wèi)h，過濾后濾 渣再次加入6倍質(zhì)量的水煮沸Ih過濾，合并三次濾液，將濾液加熱濃縮至lOOOmL，冷卻后 3000rpm離心10min，除去雜質(zhì)，蒸餾水定容制成1000 mL ;用一步醇沉法提取，向上述濃縮液 中緩慢加入95wt %乙醇使混合液中乙醇的終濃度達(dá)80wt %，邊加邊攪拌，添加完成后靜置 24h，離心，取沉淀置于60°C烘干箱干燥，即得玉屏風(fēng)總多糖一YPF-PSte; 對(duì)上述獲得的玉屏風(fēng)總多糖行純化，具體步驟如下： 分別取YPF-PSte500mg溶解于IOmL蒸餾水中，得到50mg. mL 1樣品，之后層析柱 (I. 6cmX90cm)，介質(zhì)為Sephadex A-25,流速0. 42mL ? min 1上樣，之后米用分部收集，用 0? 05mol ? L 1NaCl和Imol ? L 1NaCl各400mL梯度洗脫，洗脫液經(jīng)透析袋透析去除氯化鈉和 雜質(zhì)即得純化多糖。2. 如權(quán)利要求1所述的新城疫疫苗玉屏風(fēng)多糖免疫增強(qiáng)劑，其特征在于：所述的玉屏 風(fēng)總多糖作為免疫增強(qiáng)劑時(shí)的具體用量為：每單位劑量疫苗配合9mg中藥免疫增強(qiáng)劑使 用。
【專利摘要】本發(fā)明屬于畜禽免疫領(lǐng)域，提供了一種畜禽免疫佐劑，具體公開了一種新城疫疫苗玉屏風(fēng)多糖免疫增強(qiáng)劑，主要采用黃芪、白術(shù)、防風(fēng)按質(zhì)量比3:1:1，通過水煎-醇沉法制備而得，其重要成分為玉屏風(fēng)多糖；采用這種免疫增強(qiáng)劑，與疫苗配合使用，能增強(qiáng)動(dòng)物免疫功能，提高動(dòng)物的抗病力和疫苗的保護(hù)率，因而在預(yù)防和控制動(dòng)物傳染性疾病上有很大的推廣價(jià)值。
【IPC分類】A61K36/481, A61P37/04, A61K39/39, A61P31/14, A61K31/715
【公開號(hào)】CN105147716
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510385579
【發(fā)明人】趙曉娜, 孫文靜, 劉建柱, 馬藤菲, 郝盼, 王勝華
【申請(qǐng)人】山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年12月16日
【申請(qǐng)日】2015年6月30日