3]可W單獨調(diào)節(jié)劑量和間隔時間W提供所述制劑的足W誘導(dǎo)或者抑制生物學(xué)效果 (使有效濃度最小化，"MEC")的血漿水平。MEC對于每一種制劑可W會有變化，但是可W根 據(jù)體外數(shù)據(jù)加W確定。實現(xiàn)MEC所需要的劑量將取決于個體特征和施用途徑。可W使用檢 測分析來確定血漿濃度。
[0054]取決于準備治療的病癥的嚴重程度和反應(yīng)性，給藥可W是單次施用或者多次施 用，治療過程持續(xù)若干小時至若干周或者直至實現(xiàn)治療。施用頻率可W根據(jù)病癥和嚴重程 度而變化。在一個實施方式中，所述制劑可W周期性地施用。劑量可W根據(jù)所期望的治療 的需要被配制成任何的量或者體積。例如，可W將1yg或者10yg的劑量施用于經(jīng)歷脈 管手術(shù)例如支架植入的患者W防止支架內(nèi)晚期丟失的發(fā)生率和嚴重程度。作為另一個實 施例，劑量可W為至少lOOyg。在運個方面，所述制劑可W作為單劑量施用、多劑量施用 和/或連續(xù)施用，例如通過在一段時間內(nèi)連續(xù)輸注。例如，劑量可W根據(jù)Banai,Am化art J. (2013),supra.中的描述施用。 陽化引E.脂質(zhì)體制造方法
[0056] 本發(fā)明的另一個方面設(shè)及用于產(chǎn)品商業(yè)制造的制造脂質(zhì)體和脂質(zhì)體制劑的方法。 運種制造方法允許按照上述內(nèi)容控制物理特性W及控制某些工藝參數(shù)，包括水與溶劑的比 率、溶劑組成和溶劑比率、囊泡制備溫度、囊泡制備剪切力、擠出溫度、擠出壓力W及擠出膜 尺寸和膜類型。
[0057] 所述脂質(zhì)體制劑的制備包括如下步驟：（1)將治療性試劑和預(yù)選擇的脂質(zhì)混合W 形成囊泡；（2)在單階段通過單尺寸設(shè)計過濾器擠出所述囊泡；和（3)超濾。使用短語單階 段過濾器擠出是指擠出步驟使用單孔隙尺寸過濾步驟。其可W包括多輪通過該單尺寸設(shè)計 過濾器但是避免如現(xiàn)有技術(shù)已知的那樣需要多輪地和/或依次地通過不同尺寸設(shè)計過濾 器，例如依次地通過1. 0ym、0. 8Jim、0. 6Jim、0. 4Jim和0. 2Jim的膜。超濾后，產(chǎn)品可W可 選地被標準化到期望的最終濃度。因為步驟（2)的所述擠出作為在低壓下的單階段擠出 進行，所W本方法相對于使用多階段的高壓擠出而言節(jié)約了操作成本和時間并且增加了產(chǎn) 率。圖1展示了制造方法的步驟。
[0058] 第一步驟包括將治療性試劑和預(yù)選擇的脂質(zhì)組分于溶液中混合W形成囊泡。在很 多情況中，所述治療性試劑和脂質(zhì)組分將被溶解成治療性試劑溶液和脂質(zhì)組分溶液，然后 將兩者混合。在運個實施方式中，所述治療性試劑溶液將具有某些物理特性，包括pH、滲透 壓和電導(dǎo)率。所述治療性試劑溶液包含所述脂質(zhì)體制劑的內(nèi)部環(huán)境。因此，所述治療性試 劑溶液的pH、電導(dǎo)率、滲透壓影響所述脂質(zhì)體制劑的內(nèi)部pH、電導(dǎo)率、滲透壓。所述內(nèi)部脂 質(zhì)體滲透壓優(yōu)選為340osmol/kg至440osmol/kg，而外部脂質(zhì)體滲透壓為270osmol/kg至 340osmol/kg。所述溶液的抑擬將所述治療性試劑溶液保持在意欲達到的抑范圍。因此， 如果使用酸性的治療性試劑，例如雙憐酸鹽，則可W使用堿性抑溶液來將所述溶液的抑保 持在6. 8至7.O之間。例如，可W由溶解在氨氧化鋼溶液中的阿倫麟酸鋼制備治療性試劑 溶液，所得的阿倫麟酸鹽溶液的抑為約6. 8,并且電導(dǎo)率為約18.Oms/cm。所述溶液可W可 選地在該過程中加熱。在一個替代的實施方式中，可W使用氯麟酸鋼或者阿倫麟酸鹽一水 合物?？蒞將所述溶液加熱至利于雙憐酸鹽在堿性溶劑中溶解的55°C至75°C的溫度，例如 如70°C。取決于所溶解的其他賦形劑和治療性試劑的量，所述溶液可W具有在340osmol/ kg至400osmol/kg范圍內(nèi)的滲透壓-其將成為內(nèi)部滲透壓。還取決于治療性試劑和賦形 劑的量，所述溶液可W具有14.0ms/cm至21.0ms/cm的電導(dǎo)率-其將成為內(nèi)部電導(dǎo)率。內(nèi) 部pH、滲透壓、電導(dǎo)率是所述脂質(zhì)體制劑的穩(wěn)定性和有效性的因素。在一個實施方式中，所 述治療性試劑溶液濃度在所述制造方法的步驟（1)的過程中可W在20g/L至120g/L的范 圍內(nèi)。所述治療性試劑溶液的制備可W與上文討論的制造方法分開進行或者在上文討論的 制造方法之前進行。
[0059] 所述脂質(zhì)組分可W為在一定體積的一種或者多種脂質(zhì)溶劑中含有所期望的初始 量的所述脂質(zhì)組分的溶液的形式?？蒞使用任何適當?shù)闹|(zhì)組分和脂質(zhì)溶劑。例如，所述脂 質(zhì)組分在脂質(zhì)體形成之前可W包含分別為3:1:2摩爾比的DSPC、DSPG和膽固醇。根據(jù)脂質(zhì) 的運種組合形成得到的脂質(zhì)體還可W具有3:1:2的摩爾比的DSPC、DSPG和膽固醇。而且， 所述脂質(zhì)溶劑可W例如包含體積比分別為77/77/6的叔下醇、乙醇和水。可用于配制本發(fā) 明的所述脂質(zhì)體的其他脂質(zhì)溶劑包括氯仿或者甲醇。所述脂質(zhì)組分被溶解在所述脂質(zhì)溶劑 中。所述脂質(zhì)溶劑可W被加熱至有利于所述脂質(zhì)組分溶解的在55°C至75°C范圍的溫度，例 如為70°C，W生成所述脂質(zhì)溶液。溶解的脂質(zhì)溶液的濃度可W為50g/L至350g/L。所述脂 質(zhì)溶液的制備可W與本文所討論的制造方法分開進行或者在本文所討論的制造方法之前 進行。
[0060] 將所述治療性試劑溶液與所述脂質(zhì)溶液混合形成多層囊泡（MLV)。藥物：脂質(zhì)比 可W通過改變脂質(zhì)溶液或者治療性試劑溶液的量來控制。溫和地加熱運兩種溶液可W可選 地被用來幫助將所述溶液混合在一起。運個過程導(dǎo)致所述治療性試劑有效地包封在多層囊 泡中。在一個實施例中，可WW5. 3份脂質(zhì)和1份治療性試劑將所述脂質(zhì)溶液添加至治療 性試劑溶液中。脂質(zhì)和藥物的運個比率（重量比）增加了所述脂質(zhì)體制劑的穩(wěn)定性而對輸 送沒有顯著的傷害。實際上，運個過程允許藥物：脂質(zhì)比在W重量計為1:4至1:8的范圍內(nèi) 變化，優(yōu)選在1:5至1:6的范圍內(nèi)變化。而且，可W在擠出步驟之前調(diào)節(jié)溶劑的濃度而無需 損害所述脂質(zhì)體的完整性。
[0061] 制造所述制劑的方法中的下一個步驟包括在單階段通過單尺寸設(shè)計過濾器擠出 所述囊泡。擠出囊泡降低了上文所述的多層囊泡的尺寸。所述方法使用單擠出步驟和低壓 力，運生產(chǎn)出尺寸和形狀高度均勻的脂質(zhì)體。擠出工序可W設(shè)及使用微射流均質(zhì)機或者其 他常規(guī)均質(zhì)機。均質(zhì)機依靠剪切能來使大的脂質(zhì)體碎化成較小的脂質(zhì)體。適合于本文是用 的均質(zhì)機包括由各個制造商生產(chǎn)的微射流均質(zhì)機，例如Boston,M的微射流均質(zhì)機。顆粒 尺寸分布可W通過常規(guī)的激光束顆粒尺寸辨別法來監(jiān)測。脂質(zhì)體通過聚碳酸醋膜或者非對 稱性陶瓷膜擠出是將脂質(zhì)體尺寸降低至相對而言充分被限定的尺寸分布的有效方法。擠出 溫度優(yōu)選為大于所述脂質(zhì)體的瞬時相溫度（transient地ase temperature) W使尺寸能夠 降低。例如，在DSPG、DSPG和膽固醇的情況中，約55°C可能是期望的?？蒞使用其他脂質(zhì) 并且它們已知的瞬時相溫度是擠出步驟期望的溫度的量度?？蒞需要多輪來實現(xiàn)所期望的 囊泡尺寸和均質(zhì)性。可W實時分析樣品W在運個步驟的過程中評價囊泡尺寸和細菌計數(shù)。
[0062]可W在單階段低壓力工藝技術(shù)中進行所述擠出步驟。在擠出工序中，MLV在一個階 段中通過在施加低壓力的同時直接擠出通過一個膜來加工一而不是通過其中利用擠出機 在高壓力下將較大的脂質(zhì)體依次通過較小的膜的多階段擠出來形成小的單層脂質(zhì)體（如 在現(xiàn)有技術(shù)中所采用的）。在一個實施方式中，單階段擠出工序在施加60psi至90psi的低 壓力的同時直接采用0. 1ym孔隙尺寸的聚碳酸醋膜或者陶瓷膜進行W獲得尺寸為IOOnm 的脂質(zhì)體。另外，該工序使用60psi至90psi的較低壓力，運顯著不同于高壓力擠出的較高 壓力（高達50化si)。
[0063]通過消除多個膜并且在低壓力下擠出，本發(fā)明的所述方法具有眾多優(yōu)點。第一，所述單階段擠出工序具有W比多階段擠出工序較少的時間進行擠出的優(yōu)點。而且，消除了 對高壓力擠出的需要有利地節(jié)省了與高壓力擠出設(shè)備相關(guān)聯(lián)的高成本。低壓力擠出機的 成本顯著較少。適合用于本發(fā)明的擠出機的一個示例是LIPEX?擠出機，可W從Nodhern Lipids,Inc.獲得。另外，用于低壓力擠出機的材料例如壓縮空氣通常花費比用于高壓力擠 出機的材料例如氮氣的花費要低。而且，將多階段擠出減少至單階段擠出對應(yīng)于廢物的類 似降低和較高的產(chǎn)率。
[0064]本方法的最后步驟包括將經(jīng)擠出的囊泡超濾成經(jīng)緩沖的溶液。雖然擠出工序產(chǎn) 生尺寸和形狀均勻的脂質(zhì)體，但是超濾設(shè)及對所述制劑施加壓力使其通過膜W將經(jīng)包封的 脂質(zhì)體與未被包封的治療性試劑、溶劑和脂質(zhì)分離。運個步驟優(yōu)選在低于所述制劑中使用 的脂質(zhì)的瞬時相溫度進行，例如在很多情況中在低于45°C進行。在超過工序的過程中可W 使用不同類型的過濾膜。超濾步驟的一個實施方式使用中空纖維過濾膜，其中所述制劑被 迫使通過纖維的開放的中空忍材，并且微分子（即，溶劑、未被包封的雙憐酸鹽、脂質(zhì)）被過 濾通過纖維的外膜，而相對較大的脂質(zhì)體保留在所述纖維中。超濾得到具有大于或者等于 96 %被包封的治療性試劑的制劑。 陽0化]超濾步驟可W進一步包括透析步驟，其中所述制劑利用一定體積的緩沖溶液進行 透析。緩沖溶液的一個實施例是憐酸鹽鹽水緩沖液（PBS)，但是可W使用在生理學(xué)滲透壓 保持陽離子和陰離子平衡的任何緩沖液。其他緩沖添加劑在本領(lǐng)域中是已知的，并且可W 包括例如薦糖、甘氨酸、班巧酸鋼和/或白蛋白。所述緩沖溶液優(yōu)選反映最終制劑的外部環(huán) 境，使得運種溶液的抑和電導(dǎo)率可W得到仔細地監(jiān)測。優(yōu)選的是，所述緩沖溶液是等滲的 并且對細胞是非毒性的?？蒞對所述緩沖溶液進行過濾W進一步減少污染物并且可W在所 述制造方法之前制備所述緩沖溶液。透析終點W達到所述制劑的期望的抑和電導(dǎo)率為標 記。
[0066]在超濾步驟結(jié)束時，可W可操作地對所述制劑進行過濾W除菌，即W保持生物負 載控制化io-burdencontrol)。在該工序的一個實施方式中，除菌過濾器被連接至裝有所 述脂質(zhì)體制劑的壓力容器。所述除菌過濾器被進一步連接至無菌接收罐。對所述脂質(zhì)體制 劑施加壓力迫使所述制劑通過所述除菌過濾器。而且，可W在該步驟的過程中獲得另一份 樣品用于細菌含量。除菌過濾器孔隙尺寸可W在〇.2ym至0.45ym的范圍內(nèi)。因為所述 制劑的所述脂質(zhì)體基本是均勻的并且沒有大的脂質(zhì)體，所W可W相對不復(fù)雜地進行除菌過 濾。
[0067] 在制造之后，所述制劑可W被標準化。最終標準化產(chǎn)生具有標準濃度的脂質(zhì)體制 劑批次。標準化分析所述產(chǎn)品的產(chǎn)率、尺寸、脂質(zhì)組成、藥物和游離藥物含量和濃度。濃度分 析可W采用本領(lǐng)域已知的方法例如HPLC、借助于分光光度計的憐酸鹽分析法進行。在確認 經(jīng)超濾的產(chǎn)品的濃度之后，可W使用一定體積的緩沖溶液將所述制劑稀釋至標準濃度。最 終的標準化還設(shè)及所述脂質(zhì)體產(chǎn)品的無菌過濾。例如，超濾后的包封雙憐酸鹽的制劑可W 使用適量的緩沖溶液稀釋W(xué)達到最終的濃度。類似地，經(jīng)超濾的產(chǎn)品可W在不同批次使用 不同量的緩沖溶液稀釋液分成準備W不同的終濃度使用的多個批次?？蒞獲得樣品W確定 所得到的所述治療性試劑的濃度。
[0068] 運種制造方法具有的優(yōu)點是所述脂質(zhì)體的物理和化學(xué)特征可W控制、監(jiān)測和再 現(xiàn)。例如，可W通過其中溶解有所述治療性試劑的所述溶液的組成來控制所述脂質(zhì)體的內(nèi) 部抑。還可W通過改變所述治療溶劑的量或者根據(jù)其是帶有電荷的試劑還是不帶有電荷的 試劑來對內(nèi)部滲透壓進行類似控制。通過選擇組成所述脂質(zhì)體的脂質(zhì)組分或者添加至溶解 活性劑的脂質(zhì)的量來控制藥物：脂質(zhì)比。增加脂質(zhì)組分的量降低了藥物：脂質(zhì)比，并且反之 亦然。低的藥物：脂質(zhì)比還降低了所述脂質(zhì)體制劑的內(nèi)部滲透壓。所述組合物的外部抑和 外部滲透壓部分地受到含有最終的產(chǎn)品的緩沖溶液的組成的影響?？蒞利用包封在所述脂 質(zhì)體中的治療性試劑和其他賦形劑的性質(zhì)來控制電導(dǎo)率。通過本發(fā)明的方法，其他的因素， 包括但不限于粘度、賦形劑質(zhì)量、無菌性、與鹽水、輸注套件和注射器（用于可注射制劑）的 相容性、和與加工設(shè)備的相容性都是可W獨立控制的。
[0069] 根據(jù)上文描述，在所述制造方法的一個優(yōu)選的實施方式中，所述制劑通過如下步 驟制備：（1)將含有治療性試劑的溶液與包含摩爾比為約3:1:2的DSPC、DSPG和膽固醇的 脂質(zhì)的溶液混合W形成囊泡，使得所述治療性試劑與脂質(zhì)的質(zhì)量比為約1:5至1:8 ;(2)在 單階段通過具有約100皿的孔隙尺寸的過濾器擠出所述囊泡；和（3)超濾。
[0070] 本發(fā)明的另一個方面是根據(jù)W上制造步驟制得的脂質(zhì)體制劑，其中所述制劑包含 摩爾比為約3:1:2的DSPC、DSPG和膽固醇，并且所述治療性試劑與脂質(zhì)的質(zhì)量比為約1:5 至1:8,并且所述脂質(zhì)體制劑通過如下步驟制造：（1)將含有治療性試劑的溶液和含有脂質(zhì) 組分的溶液混合W形成囊