器^確保在測量 過程中均質(zhì)地分散樣品。一個(gè)諧振器裝有W麟脂計(jì)濃度為lOmg/ml的脂質(zhì)體溶液，而另一 個(gè)諧振器填充由相同的緩沖溶液巧BS或者肥PE巧但是沒有囊泡作為參照物。當(dāng)開始一 系列測量時(shí)，首先通過測量帶有相同參照液體的兩個(gè)單元來比較兩個(gè)諧振器的諧振頻率。 由于音頻信號的能量密度全都比較?。ǔ暡ǖ膲毫Ψ敌∮趌〇3Pa)，因此避免了聲波 對囊泡的結(jié)構(gòu)性能的任何影響。一般來說，超聲測速儀允許根據(jù)如下定義的等式測定聲 速（U)而不是其濃度依賴性增量（SarvazyanA.P. (1982)!Developmentofmethodsof precisemeasurementsinsmallvolumesofliquids(小體積液體中的精確測量方法的 發(fā)展），叫trasonics20,151-154):
[0105] 其中，C是^mg/ml表示的溶質(zhì)濃度，并且下標(biāo)"0"表示溶劑（緩沖液）。根據(jù)兩 個(gè)諧振器的諧振頻率f和f。的變化可^直接確定[U]值（f是樣品的諧振頻率，而f。是參 照物-緩沖液的諧振頻率）：
[0107]使用根據(jù)振動(dòng)管原理（Kratky0?，Leopold比，StabingerH. (1973) :The determinationofthepartialspecificvolumeofproteinsbythemechanical oscillatortechnique(通過機(jī)械式振蕩器技術(shù)確定蛋白質(zhì)的微分比容）），In:Me化odsin Enzymology巧d.E.Grell)，vol. 27,PP. 98-110,AcademicPress,London)操作的高精度密 度測量系統(tǒng)（帶有兩個(gè)DMA602M樣品室的DMA60,AntonPaarKG，Graz,Austria)來確定 囊泡溶液的密度（P)。微分表觀比容（A卵a(bǔ)rentspecificpartialvolumes, <{)V)使用 如下等式根據(jù)密度數(shù)據(jù)來計(jì)算：
陽109]其中，下標(biāo)"0"同樣表示參照溶劑并且[P] = (P-PoV(PoC)表示密度的濃度 增量。單元的溫度使用Lauda服8CS超級恒溫器（ultra-thermostat,Lauda,Germany)控 制在±0. 02°C內(nèi)。
[0110] 除了聲音-速度濃度增量之外，確定比容也允許根據(jù)如下等式估測囊泡的下降的 表觀比可壓縮性卿/輪:
[0112] 其中，0。是可壓縮性的系數(shù)，并且P。是緩沖液密度（Sarva巧anl991)。（Pk/P〇的 值表示脂質(zhì)體相對于緩沖液的體積可壓縮性。較高的期1巧〇值意味著脂質(zhì)體的可壓縮性較 高（即剛性較?。?br>[0113] 為了測定脂質(zhì)體的比容可壓縮性，測量了超聲速度[U]和密度P的濃度增量。然 后通過等式（4, 5)確定比容可壓縮性巧V和表觀比可壓縮性(Pk/(3〇。
[0114] 圖4證明本發(fā)明的脂質(zhì)體與其他脂質(zhì)體制劑和空脂質(zhì)體相比基本是剛性的。如圖 4所示，LSA脂質(zhì)體的比可壓縮性（與剛性成反比）顯著低于采用現(xiàn)有技術(shù)常規(guī)配方制得的 那些空脂質(zhì)體的比可壓縮性。LSA脂質(zhì)體的可壓縮性為約0. 70,而空脂質(zhì)體的可壓縮性為 約0. 90。KS和皿脂質(zhì)體的比可壓縮性顯著不同，為0. 75。運(yùn)個(gè)實(shí)施例證明機(jī)械性能對制 劑和藥物在脂質(zhì)體內(nèi)部的存在是敏感的。
[0115] 實(shí)施例3-脂質(zhì)體穩(wěn)定性分析
[0116] 根據(jù)實(shí)施例1制得的脂質(zhì)體制劑的穩(wěn)定性例舉在表4和5中。表4證明了本發(fā)明 的脂質(zhì)體在4°C保存至少直達(dá)36個(gè)月時(shí)是穩(wěn)定的，并且所述制劑滿足所有的要求規(guī)范。
[0117] 表4-在4°C的穩(wěn)定性 陽11引
[0120] 表5證明了本發(fā)明的脂質(zhì)體在25°C保存直達(dá)7個(gè)月時(shí)是穩(wěn)定的，并且所述制劑滿 足所有的要求規(guī)范。
[0121] 表5-在25 °C的穩(wěn)定性
[0124] 實(shí)施例4 -脂質(zhì)體均勻性分析
[01巧]通過使用MalvernNanoZS顆粒尺寸測量系統(tǒng)分析脂質(zhì)體制劑的均勻性。運(yùn)個(gè)程 序通過動(dòng)態(tài)光散射法值ynamicLi曲tScattering,化巧確定了脂質(zhì)體制劑的囊泡尺寸的 均勻性并表征了懸浮在液體介質(zhì)中的顆粒的尺寸分布。運(yùn)個(gè)技術(shù)對于IOnm至IOOnm范圍 內(nèi)的顆粒尺寸分布是敏感的，并且可W用于一系列的顆粒，包括脂質(zhì)體乳液、納米顆粒和合 成聚合物。該技術(shù)可W被用來提供均質(zhì)脂質(zhì)體制劑的平均直徑W及制劑異質(zhì)性的指示。在 根據(jù)操作說明書標(biāo)準(zhǔn)化MalvernNano-ZS顆粒尺寸測量系統(tǒng)之后，首先按照1/3將0. 5mg/ ml的脂質(zhì)體樣品稀釋在PBS中。使用叫traspec21(K)proUV/VIS分光光度計(jì)確認(rèn)稀釋溶 液的UVA最大600nm。再將脂質(zhì)體樣品稀釋直到獲得最優(yōu)的光密度（0.D.)值.10 + 0. 02。再 次確認(rèn)第二稀釋溶液的UVA最大600nm具有0. 10 + 0. 020.D的值。然后，將1.Oml至1. 5ml 的稀釋樣品放置于培養(yǎng)管中，并且通過MalvernNano-ZS顆粒尺寸系統(tǒng)分析囊泡尺寸。分 析在環(huán)境溫度（23°C±2°C)、173°的固定角、633nm的激光波長進(jìn)行。累積數(shù)據(jù)W獲得150 至 500Kcps(千計(jì)數(shù) / 秒化iIocountspersecond))。
[0126] 表6展示了根據(jù)本發(fā)明制得的制劑的測量結(jié)果。平均脂質(zhì)體尺寸為80. 41nm，PDI 為 0. 04。
[0127]表6
[0130] 根據(jù)上文所述程序分析了在上文實(shí)施例2中描述的現(xiàn)有技術(shù)脂質(zhì)體皿脂質(zhì)體的 均勻性。皿脂質(zhì)體的Z-平均尺寸為176. 5皿。 陽131] 圖5A和5B分別展示了根據(jù)本發(fā)明制得的脂質(zhì)體和皿脂質(zhì)體的尺寸分布。圖5A 顯示了本發(fā)明的脂質(zhì)體制劑具有約88nm的平均直徑，并且直徑尺寸緊密地分布在69nm至 107皿的范圍。相反，圖5B顯示皿脂質(zhì)體制劑具有約201皿的平均直徑，脂質(zhì)體的直徑從低 至SOnm至高達(dá)500nm。圖5A中的制劑的PDI為0. 025。圖5B的皿制劑的PDI為0. 118。
[0132] 本文引用的所有公開的期刊、書籍、參考手冊和摘要再次通過參引的方式全部引 入本文W更加充分地描述本發(fā)明所述技術(shù)領(lǐng)域的狀態(tài)。
[0133] 由于可W對上文所述的主題進(jìn)行各種改變而沒有脫離本發(fā)明的范圍和精神，因此 打算包含在上述說明中或者限定在所附的權(quán)利要求書中的所有主題都應(yīng)被解釋為是本發(fā) 明的描述性的和例舉性的。根據(jù)上文教導(dǎo)，本發(fā)明的很多改變和變化都是可能的。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種具有脂質(zhì)組分并且包封治療性試劑的脂質(zhì)體，所述脂質(zhì)體具有約1:5至1:8的 所述治療性試劑與脂質(zhì)的質(zhì)量比，其中所述脂質(zhì)組分包含摩爾比為約3:1:2的DSPC、DSPG 和膽固醇，并且所述脂質(zhì)體具有小于0. 70ml/g的可壓縮性。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂質(zhì)體，其中，所述脂質(zhì)體帶有負(fù)電荷。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂質(zhì)體，其中，所述脂質(zhì)體具有340osmol/kg至440osmol/kg 的脂質(zhì)體內(nèi)滲透壓。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂質(zhì)體，其中，所述脂質(zhì)體具有13. 5ms/cm至17. 5ms/cm的脂 質(zhì)體內(nèi)電導(dǎo)率。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂質(zhì)體，其中，所述治療性試劑是雙磷酸鹽。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的脂質(zhì)體，所述脂質(zhì)體在該脂質(zhì)體內(nèi)具有0. 5mg/ml至5mg/ml 的雙磷酸鹽濃度。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂質(zhì)體，其中，所述脂質(zhì)體具有約6. 9的脂質(zhì)體內(nèi)pH。8. -種包含多個(gè)脂質(zhì)體的制劑，所述脂質(zhì)體具有脂質(zhì)組分和治療性試劑，其中，所述脂 質(zhì)組分包含摩爾比為約3:1:2的DSPC、DSPG和膽固醇，并且所述制劑具有小于0. 07的。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的制劑，其中，所述脂質(zhì)體帶有負(fù)電荷。10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的制劑，其中，所述脂質(zhì)體具有340osmol/kg至440osmol/kg 的脂質(zhì)體內(nèi)滲透壓。11. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的制劑，其中，所述脂質(zhì)體具有13. 5ms/cm至17. 5ms/cm的脂 質(zhì)體內(nèi)電導(dǎo)率。12. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的制劑，其中，所述脂質(zhì)體具有約80±5nm的平均尺寸。13. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的制劑，其中，所述治療性試劑是雙磷酸鹽。14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的制齊IJ，所述制劑在所述脂質(zhì)體內(nèi)具有0. 5mg/ml至5mg/ml 的雙磷酸鹽濃度。15. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的制劑，其中，所述制劑中的至少96%的所述治療性試劑被包 封。16. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的制劑，所述制劑具有約1:5至1:8的所述治療性試劑和所述 脂質(zhì)組分的質(zhì)量比。17. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的制劑，其中，所述制劑具有約6. 9的脂質(zhì)體內(nèi)pH。18. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的制劑，其中，所述脂質(zhì)體具有不超過0. 70ml/g的可壓縮性。19. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的制劑，其中，所述PDI為0. 02至0. 05。20. -種制造具有多個(gè)脂質(zhì)體的治療性制劑的方法，所述方法包括如下步驟： (a) 將含有治療性試劑的溶液與含有脂質(zhì)的溶液混合以形成囊泡，使得所述治療性試 劑與脂質(zhì)的質(zhì)量比為約1:5至1:8,所述脂質(zhì)包含摩爾比為約3:1:2的DSPC、DSPG和膽固 醇； (b) 在單階段中通過具有約IOOnm的孔隙尺寸的過濾器擠出所述囊泡；以及 (c) 對所述囊泡進(jìn)行超濾。21. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，所述方法進(jìn)一步包括如下步驟：(d)使用磷酸鹽緩沖 鹽水溶液稀釋所述制劑以形成所述治療性制劑的治療性試劑的最終濃度。22. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中，所述治療性制劑具有約6. 9的pH。23. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中，所述脂質(zhì)溶劑包含乙醇、叔丁醇和水。24. 根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中，乙醇、叔丁醇和水的體積比為77/77/6。25. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中，步驟（b)的所述擠出在55 °C至75 °C之間進(jìn)行。26. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中，步驟（b)的所述擠出在60psi至90psi之間的 壓力下進(jìn)行。27. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中，步驟（b)的所述擠出在超濾之前重復(fù)10至18 次。28. -種包含多個(gè)脂質(zhì)體的制劑，所述脂質(zhì)體由一定量的脂質(zhì)組分和治療性試劑組成， 所述脂質(zhì)組分包含摩爾比為約3:1:2的DSPC、DSPG和膽固醇，并且所述治療性試劑和脂質(zhì) 的質(zhì)量比為約1:5至1:8,所述制劑通過如下步驟制造： (a) 將含有治療性試劑的溶液與含有脂質(zhì)的溶液混合以形成囊泡，使得所述治療性試 劑與脂質(zhì)的質(zhì)量比為約1:5至1:8,所述脂質(zhì)包含摩爾比為約3:1:2的DSPC、DSPG和膽固 醇； (b) 在單階段中通過具有約IOOnm的孔隙尺寸的過濾器擠出所述囊泡；以及 (c) 對所述囊泡進(jìn)行超濾。29. 根據(jù)權(quán)利要求28所述的制劑，所述制劑進(jìn)一步采用如下步驟來形成：(d)使用磷酸 鹽緩沖鹽水溶液稀釋所述制劑以形成所述制劑的最終濃度。30. 根據(jù)權(quán)利要求28所述的制劑，其中，所述制劑具有約6. 9的pH。31. 根據(jù)權(quán)利要求28所述的制劑，其中，所述脂質(zhì)溶劑包含乙醇、叔丁醇和水。32. 根據(jù)權(quán)利要求31所述的制劑，其中，乙醇、叔丁醇和水的體積比為77/77/6。33. 根據(jù)權(quán)利要求28所述的制劑，其中，步驟（b)的所述擠出在55°C至75°C之間進(jìn)行。34. 根據(jù)權(quán)利要求28所述的制劑，其中，步驟（b)的所述擠出在60psi至90psi之間的 壓力下進(jìn)行。35. 根據(jù)權(quán)利要求28所述的制劑，其中，步驟（b)的所述擠出在超濾之前重復(fù)10至18 次。36. 根據(jù)權(quán)利要求28所述的制劑，其中，所述制劑具有小于0. 07的H)I。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種含有治療性試劑的脂質(zhì)體制劑和用于制備所述制劑的方法。所述脂質(zhì)體制劑具有增強(qiáng)所述制劑的均勻性和穩(wěn)定性的特殊性質(zhì)。所述制造方法是一種新穎的方法，該方法制造出具有均勻尺寸的脂質(zhì)體制劑，該脂質(zhì)體制劑帶有可以獨(dú)立地控制的很多期望性能。而且，本發(fā)明還涉及根據(jù)所述制造方法制得的脂質(zhì)體制劑。
【IPC分類】A61K9/127
【公開號】CN105188674
【申請?zhí)枴緾N201380074613
【發(fā)明人】約拉姆·里克特, 耶胡達(dá)·策利希, 奧馬爾·埃爾馬拉克, 德羅爾·埃亞勒
【申請人】生物休眠有限公司
【公開日】2015年12月23日
【申請日】2013年3月14日
【公告號】CA2906273A1, EP2968141A1, WO2014140670A1