。
[0034] 5)4h后扣板法倒去上清，用吸水紙輕輕拍干，每孔加入200 y 1二甲基亞砜，置搖 床上低速振蕩l〇min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀490nm處測量各孔的吸光值。
[0035] 6)同時(shí)設(shè)置本底（不加細(xì)胞，只加培養(yǎng)液），對照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解 介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜），每組設(shè)定6個(gè)復(fù)孔。
[0036] 7)結(jié)果以藥物對細(xì)胞的抑制率表示：
[0037] 細(xì)胞增值抑制率（％ )=(對照孔OD值-給藥孔OD值）/對照孔OD值X 100 %。 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
[0038] 3統(tǒng)計(jì)處理
[0039] 采用MicrosoftExcel2003軟件中的相關(guān)分析和Studentt檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以 meaniS.D.表不。
[0040] 4實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0041] MTT法實(shí)驗(yàn)后統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，與對照組比較，當(dāng)劑量達(dá)到5mg/ml時(shí)，對SF295細(xì) 胞增殖抑制有差異（P〈〇. 05)，劑量在lOmg/ml時(shí)該差異具有顯著性（P〈0. 01)，當(dāng)劑量達(dá)到 15-20mg/ml時(shí)有極顯著性差異（P〈0. 001)。
[0042] 表1蠻龍液對小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞增殖抑制影響研究
[0043]
[0044] 注：與對照組比較，*P〈0.0 l ;#P〈0. 001，與蒼耳子組比較，#P〈0.0 l ;##P〈0.0 Ol
[0045] 5實(shí)驗(yàn)結(jié)論
[0046] 蠻龍液可以抑制小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞增殖，減少小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞的細(xì)胞 生長數(shù)目，該作用呈劑量依賴性，而且與市售蠻龍液相比也有顯著性差異。
[0047] 實(shí)施例4 :本發(fā)明蠻龍液治療或預(yù)防登革病毒感染的研究
[0048] A.本發(fā)明對Vero細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn)：
[0049] Vero細(xì)胞（非洲綠猴腎細(xì)胞）是DENV的易感細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)中的Vero細(xì)胞購 買于中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資料中心；MTT試劑盒購于碧云天生物技術(shù)研究所；胎 牛血清（Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS)購買于美國GIBCO公司；細(xì)胞培養(yǎng)板購買于德國 Greinerbioone公司；DMEM培養(yǎng)基和MEM培養(yǎng)基購買于美國GIBCO公司。
[0050] 實(shí)驗(yàn)步驟如下：
[0051] 1 :接種Vero細(xì)胞：用含10% (v/v)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基配成單個(gè)細(xì)胞懸液， 以每孔1000-10000個(gè)細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔接種體積IOOul ;
[0052] 2 :培養(yǎng)Vero細(xì)胞：在37°C，5% (v/v) C02培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)2天；
[0053] 3 :加入本發(fā)明：取按上述實(shí)施例3制備的蠻龍液5ml，0. 2 y m濾器過濾，備用。吸 棄每個(gè)孔中的DMEM培養(yǎng)基，向各個(gè)孔中加入IOOul用含10% (v/v)胎牛血清的DMEM培養(yǎng) 基稀釋成相應(yīng)濃度（〇uM，0. 4uM，I. 2uM，3. 7uM，11uM，33uM，100uM，300uM)的本發(fā)明，對照孔 加不加含10% (v/v)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基IOOul ;
[0054] 4 :呈色：培養(yǎng)48小時(shí)后，每孔加MTT溶液10ul，在37°C，5% (v/v) C02培養(yǎng)條件 下繼續(xù)孵育4小時(shí)，然后加入Formazan溶解液，在37°C，5% (v/v) C02培養(yǎng)條件下繼續(xù)孵育 4小時(shí)，直至在普通光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)Formazan全部溶解；
[0055] (1):測量：在570nm測定吸收值。
[0056] 表1不同濃度的本發(fā)明對Vero細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn)
[0057]
[0058] B.本發(fā)明對DENV的抑制實(shí)驗(yàn)：
[0059] 以Vero細(xì)胞為培養(yǎng)病毒DENV的細(xì)胞，MOI為0. 1，實(shí)驗(yàn)步驟如下：在24孔細(xì)胞培 養(yǎng)板中接入Vero細(xì)胞，24小時(shí)后細(xì)胞長至單層（細(xì)胞覆蓋孔底的面積約為80%~90% )， 吸出培養(yǎng)基，接入病毒樣品200ul，37°C吸附2小時(shí)。吸附完成后，吸棄各孔中的病毒液，用 DMEM培養(yǎng)基洗去未吸附的病毒。加入用含10% (v/v)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋的指定 濃度（〇uM，0. 04uM，0. 12uM，0. 37uM，I. luM，3. 3uM，10.0 uM)的本發(fā)明，于 37°C、5% (v/v)C02 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)42小時(shí)，收集各個(gè)孔中的上清，做病毒噬斑實(shí)驗(yàn)。
[0060] 病毒噬斑實(shí)驗(yàn)：在24孔板中接入Vero細(xì)胞，24小時(shí)后細(xì)胞長至單層（細(xì)胞覆蓋 孔底的面積約為80%~90%)，吸棄各孔中的培養(yǎng)基，接入用含3% (v/v)胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基10倍系列稀釋的病毒樣品200ul，37°C吸附2小時(shí)。吸附完成后將各個(gè)孔的上清板 吸棄，用10% (v/v)FBS的DMEM培養(yǎng)基洗去未吸附的病毒。加入新鮮的45°C預(yù)熱的半固 定培養(yǎng)基[A成分：3% (v/v)FBS，2XMEM培養(yǎng)基，青霉素（美國AMRESC0)和鏈霉素（美國 AMRESC0)終濃度分別為 100U/ml，0. lmg/ml ;B 成分：1% (w/v)的瓊脂糖（法國 Biowest)。 A成分：B成分=l:l(v/v)]，于37°C、5% (v/v)C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48~72小時(shí)。待噬 斑形成后用結(jié)晶紫（美國AMRESC0)染色（2% (w/v)結(jié)晶紫溶于10% (v/v)甲醛），2小時(shí) 后用流水沖去結(jié)晶紫和瓊脂糖，在顯微鏡下對每孔產(chǎn)生的細(xì)胞噬斑，根據(jù)噬斑數(shù)和稀釋倍 數(shù)計(jì)算病毒的滴度（PFU/ml，PFU :plaque formation unit 斑形成單位）。PFU =病毒稀 釋度XP/V，（P :空蝕斑數(shù)目；V :接種量）。在2次不同的時(shí)間進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
[0061] 表2不同濃度的本發(fā)明對DENV滴度降低及抑制作用
[0062]
[0063] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果：本發(fā)明通過對DENV的抑制實(shí)驗(yàn)證 實(shí)了本發(fā)明對DENV具有很好的抑制作用，從本質(zhì)上證明了該藥物在治療DENV感染疾病中 具有廣泛的應(yīng)用背景。該發(fā)明能夠?yàn)榕R床治療由DENV引起的疾病提供很好的候選藥物，具 有十分良好的應(yīng)用前景。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種蠻龍液的制備方法，由雄蠶蛾25g、刺五加25g、酒制菟絲子17. 5g、淫羊藿20g、 鹽制熟地黃l〇g、鹽制補(bǔ)骨脂IOg作為原料藥制成，其特征在于所述的方法由下列步驟組 成：取雄蠶蛾25g、刺五加25g、酒制菟絲子17. 5g、淫羊藿20g、鹽制熟地黃10g、鹽制補(bǔ)骨脂 l〇g，粉碎，加入2L的70%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率400-600W，萃 取2次，每次4-8分鐘，合并萃取液，濃縮，加到DlOl大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收 集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮，加蔗糖、白酒及適量水調(diào)整總量至800ml，混 勾，即得。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述蠻龍液的制備方法，其特征在于所述微波萃取功率500W，每次 萃取6分鐘。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述蠻龍液在制備抑制小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng) 用，其特征在于蠻龍液由雄蠶蛾25g、刺五加25g、酒制菟絲子17. 5g、淫羊藿20g、鹽制熟地 黃l〇g、鹽制補(bǔ)骨脂IOg作為原料藥制成，制備方法由下列步驟組成：取雄蠶蛾25g、刺五加 25g、酒制菟絲子17. 5g、淫羊藿20g、鹽制熟地黃10g、鹽制補(bǔ)骨脂10g，粉碎，加入2L的70 % 乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率400-600W，萃取2次，每次4-8分鐘，合 并萃取液，濃縮，加到DlOl大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減 壓回收乙醇，濃縮，加蔗糖、白酒及適量水調(diào)整總量至800ml，混勻，即得。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述蠻龍液在制備抑制小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用， 其特征在于所述微波萃取功率500W，每次萃取6分鐘。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述蠻龍液在制備治療或預(yù)防登革病毒感染藥物中的應(yīng)用，其特征 在于蠻龍液由雄蠶蛾25g、刺五加25g、酒制菟絲子17. 5g、淫羊藿20g、鹽制熟地黃10g、鹽制 補(bǔ)骨脂IOg作為原料藥制成，制備方法由下列步驟組成：取雄蠶蛾25g、刺五加25g、酒制菟 絲子17.58、淫羊藿2(^、鹽制熟地黃1(^、鹽制補(bǔ)骨脂1(^，粉碎，加入21的70%乙醇，投入 微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率400-600W，萃取2次，每次4-8分鐘，合并萃取液， 濃縮，加到DlOl大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙 醇，濃縮，加蔗糖、白酒及適量水調(diào)整總量至800ml，混勻，即得。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述蠻龍液在制備治療或預(yù)防登革病毒感染藥物中的應(yīng)用，其特征 在于所述微波萃取功率500W，每次萃取6分鐘。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種蠻龍液的制備方法，由雄蠶蛾25g、刺五加25g、酒制菟絲子17.5g、淫羊藿20g、鹽制熟地黃10g、鹽制補(bǔ)骨脂10g作為原料藥制成，采用微波萃取制備而成，使得含量有很大提高，服用量減少，本發(fā)明還提供了蠻龍液在制備抑制小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞增殖藥物和治療或預(yù)防登革病毒感染藥物中的應(yīng)用。
【IPC分類】A61K36/804, A61K9/08, A61K35/64, A61P35/00
【公開號】CN105193715
【申請?zhí)枴緾N201510694934
【發(fā)明人】楊建云
【申請人】云南云龍制藥股份有限公司
【公開日】2015年12月30日
【申請日】2015年10月23日