恢復(fù)疾病斑馬魚的行為能力的效果，且其中又W 濃度250毫克/公斤的效果最明顯。
[0049] (3)共輛焦顯微鏡試驗(yàn)
[0050]W300奈莫耳濃度/微升ATXN3M0、250毫克/公斤亞了基苯獻(xiàn)、或ATXN3M0合并 250毫克/公斤亞了基苯獻(xiàn)、125毫克/公斤亞了基苯獻(xiàn)、或62. 5毫克/公斤亞了基苯獻(xiàn)微 注射處理魚卵，48小時(shí)后，將魚體封入玻片中，W共輛焦顯微鏡進(jìn)行活體英光運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元拍 攝。
[0051] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，野生型的斑馬魚中沒有特殊的神經(jīng)損傷，且只注射亞了基苯獻(xiàn)及 CtM0也未出現(xiàn)明顯的神經(jīng)損傷；但在注射Ataxin-3M0后，會(huì)導(dǎo)致斑馬魚的神經(jīng)信號(hào)明顯 減弱，由此證明Ataxin-3M0具有神經(jīng)損傷效果且具有專一'生。此外，如圖4所示，W250毫 克/公斤亞了基苯獻(xiàn)治療ATXN3M0斑馬魚，具有維持運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)量的效果。其中，圖4所 示數(shù)據(jù)為存活數(shù)/總只數(shù)*100%所得。
[0052][實(shí)施例3]小鼠活體內(nèi)試驗(yàn)
[0053] 本實(shí)驗(yàn)使用MJD84. 2基因轉(zhuǎn)殖小鼠（即，經(jīng)人類84CAG重復(fù)ATXN3基因轉(zhuǎn)殖的小 鼠，簡(jiǎn)稱SCA3小鼠）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。MJD84. 2基因轉(zhuǎn)殖小鼠為研究脊髓性小腦萎縮癥的動(dòng)物模 型，送類小鼠會(huì)在出生后4周內(nèi)出現(xiàn)步態(tài)異常的情況，之后會(huì)開始陸續(xù)出現(xiàn)輕度震顫、中度 活動(dòng)能力減退、前/后肢不正常收縮（約24周齡）、及有無力趴地的情況。
[0054] (1)MJD84. 2基因轉(zhuǎn)殖小鼠的治療
[0055] 將二周齡的MJD84. 2基因轉(zhuǎn)殖小鼠隨機(jī)分為5個(gè)組別，每組6只，分別W如下列條 件進(jìn)行處理2周；（1)未處理；（2)喂食橄攬油（即，僅喂食佐劑）；（3)喂食亞了基苯獻(xiàn)100 毫克/公斤/每天分兩次喂食化id) ; (4)喂食亞了基苯獻(xiàn)500毫克/公斤/每天分兩次喂 食化id) ; (5)喂食3-亞了基-4, 5-二氨苯獻(xiàn)100毫克/公斤/每天分兩次喂食化id);另 W野生型小鼠（WT)作為控制組。2周后，開始進(jìn)行，Localmotor及轉(zhuǎn)棒測(cè)試。
[0056] (2)Localmotor測(cè)試
[0057] 進(jìn)行Localmotor測(cè)試，W測(cè)試小鼠的運(yùn)動(dòng)能力。
[005引使10周齡的小鼠于轉(zhuǎn)棒（rotarod)上進(jìn)行了測(cè)試，每3周測(cè)試一次。接著，將小 鼠放置在一個(gè)透明的壓克力盒2小時(shí)，使它自由移動(dòng)，利用機(jī)器VersaMax420(AccuscanIns trumentsinc，USA)進(jìn)行1小時(shí)的行為測(cè)試后，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計(jì)。
[0059] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5A、5B、及5C所示，相較于未處理及經(jīng)橄攬油喂食組，經(jīng)亞了基苯獻(xiàn) 或3-亞了基-4, 5-二氨苯獻(xiàn)喂食組的小鼠的總移動(dòng)距離（圖5A)、移動(dòng)次數(shù)（圖5B)、及 移動(dòng)時(shí)間（圖5C)都較長(zhǎng)，顯示其運(yùn)動(dòng)能力較佳。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示亞了基苯獻(xiàn)及3-亞了 基-4, 5-二氨苯獻(xiàn)可改善MJD84. 2基因轉(zhuǎn)殖小鼠的運(yùn)動(dòng)行為。
[0060] (3)轉(zhuǎn)棒（rotarod)測(cè)試
[0061] 進(jìn)行轉(zhuǎn)棒測(cè)試，W測(cè)試小鼠的平衡能力及抓握能力。測(cè)試之前，先使小鼠練習(xí)二星 期后，再進(jìn)行第一次行為測(cè)試，此實(shí)驗(yàn)為利用IITC轉(zhuǎn)棒（nTCLifeScienceInc,美國）進(jìn) 行測(cè)試。使10周齡的小鼠于轉(zhuǎn)棒（rotarod)上進(jìn)行了測(cè)試，每3周測(cè)試一次，條件為在300 砂內(nèi)從4至40轉(zhuǎn)進(jìn)行線性加速，記錄小鼠自轉(zhuǎn)棒掉落（latencytofall)的時(shí)間（砂）。 每次試驗(yàn)持續(xù)最多5分鐘，在每次測(cè)驗(yàn)之間使小鼠至少休息15分鐘，W避免疲勞。轉(zhuǎn)棒試 驗(yàn)后，記錄小鼠的體重。小鼠去每天進(jìn)行3次試驗(yàn)，連續(xù)四天，W每天平均自轉(zhuǎn)棒掉落下降 的時(shí)間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
[0062] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，相較于未處理及經(jīng)橄攬油喂食組，在經(jīng)亞了基苯獻(xiàn)或3-亞 了基-4, 5-二氨苯獻(xiàn)喂食的組別中，小鼠的平衡能力及抓握能力較佳，顯示亞了基苯獻(xiàn)及 3-亞了基-4, 5-二氨苯獻(xiàn)可改善MJD84. 2基因轉(zhuǎn)殖小鼠的運(yùn)動(dòng)行為。
[0063][實(shí)施例4]組織化學(xué)染色試驗(yàn)
[0064] 將八周齡的MJD84. 2基因轉(zhuǎn)殖小鼠（即，具有經(jīng)修飾的ATXN3gene)隨機(jī)分為5個(gè) 組別，每組6化并W下列條件進(jìn)行處理；（1)未處理；似喂食橄攬油；（3)喂食亞了基苯獻(xiàn) 100毫克/公斤/每天分兩次喂食化id) ; (4)喂食亞了基苯獻(xiàn)500毫克/公斤/每天分兩次 喂食化id) ; (5)喂食3-亞了基-4, 5-二氨苯獻(xiàn)100毫克/公斤/每天分兩次喂食化id)。 之后，分別在第20周及24周時(shí)犧牲小鼠并進(jìn)行小腦切片染色及組織蛋白萃?。▍⒁妼?shí)施 例5)，W3. 7%福爾馬林隔夜固定小鼠全腦組織后，將樣品包埋入石蠟中。使用如anto套 組（Thermo,美國）將樣品進(jìn)行切片（4微米）并安裝在顯微鏡幻燈片上。
[0065] 圖7所示為SCA3小鼠免疫化學(xué)組織染色小腦的切片染色結(jié)果，其中，未治療組及 經(jīng)橄攬油喂食組顯示明顯的浦肯野細(xì)胞缺失，但經(jīng)亞了基苯獻(xiàn)或3-亞了基-4, 5-二氨苯獻(xiàn) 治療的組別的小鼠，其浦肯野細(xì)胞數(shù)量顯著多于未治療組別及橄攬油組，此實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示 亞了基苯獻(xiàn)及3-亞了基-4, 5-二氨苯獻(xiàn)治療可可延緩或避免浦肯野細(xì)胞死亡。
[0066][實(shí)施例引西方墨點(diǎn)法
[0067] 取于實(shí)施例4犧牲的SCA3小鼠的全腦組織，進(jìn)一步分離出小腦組織，并進(jìn)行蛋 白質(zhì)萃取。將所得純化蛋白質(zhì)分別使用抗-泛素（ubiquitin)抗體W及抗-巧結(jié)合蛋白 (ca化indin)抗體進(jìn)行西方墨點(diǎn)法分析，W測(cè)定各組別的SCA3小鼠的小腦組織的泛素及巧 結(jié)合蛋白的蛋白質(zhì)含量變化。實(shí)驗(yàn)w目-肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)控制組。
[0068] 如圖8所示，相較于未治療組及經(jīng)橄攬油喂食組，經(jīng)亞了基苯獻(xiàn)或3-亞了 基-4, 5-二氨苯獻(xiàn)治療的組別的小鼠其巧結(jié)合蛋白的蛋白質(zhì)表現(xiàn)量明顯較高。已知巧結(jié)合 蛋白為浦肯野細(xì)胞的標(biāo)記物（marker)，此實(shí)驗(yàn)結(jié)果與切片結(jié)果皆顯示浦肯野細(xì)胞的數(shù)量增 加，證實(shí)亞了基苯獻(xiàn)及3-亞了基-4, 5-二氨苯獻(xiàn)可減緩SCA3疾病進(jìn)程。
[0069] 此外，如圖9所示，相較于未治療組及經(jīng)橄攬油喂食組，經(jīng)亞了基苯獻(xiàn)治療的組別 的小鼠其經(jīng)泛素進(jìn)行泛素化（ubiquitinubiquitination)的蛋白質(zhì)的含量明顯較高，顯示 亞了基苯獻(xiàn)具有增加泛素進(jìn)行泛素化的能力，亦即，可增加小腦神經(jīng)細(xì)胞中蛋白質(zhì)的泛素 化作用，故可增加錯(cuò)誤蛋白通過蛋白酶體（proteasome)代謝的效率，減緩SCA3的疾病進(jìn) 程。
[0070] W上實(shí)施例的結(jié)果顯示，使用本發(fā)明所涉特定苯獻(xiàn)化合物可治療及/或延緩浦肯 野細(xì)胞退化，故可治療脊髓性小腦萎縮癥、阿茲海默癥、帕金森氏癥及/或延緩其發(fā)病。
[0071] 上述實(shí)施例僅是用W例示說明本發(fā)明的原理及功效，而非用于限制本發(fā)明。任何 熟于此項(xiàng)技藝的人±均可在不違背本發(fā)明的技術(shù)原理及精神的情況下，對(duì)上述實(shí)施例進(jìn)行 修改及變化，都應(yīng)當(dāng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種使用一苯酞化合物于制備用于治療及/或延緩浦肯野細(xì)胞退化的藥劑的用途， 其特征是，該苯酞化合物選自以下群組：亞丁基苯酞、亞丁基苯酞的代謝前驅(qū)物、亞丁基苯 酞的代謝前驅(qū)物的醫(yī)藥可接受鹽、亞丁基苯酞的代謝前驅(qū)物的醫(yī)藥可接受酯、以及前述的 任意組合。2. 根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其特征是，該苯酞化合物為亞丁基苯酞。3. 根據(jù)權(quán)利要求2的用途，其特征是，該亞丁基苯酞包含90%或更高的Z-亞丁基苯酞。4. 根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其特征是，該苯酞化合物是亞丁基苯酞的代謝前驅(qū)物、亞丁 基苯酞的代謝前驅(qū)物的醫(yī)藥可接受鹽、及/或亞丁基苯酞的代謝前驅(qū)物的醫(yī)藥可接受酯。5. 根據(jù)權(quán)利要求3的用途，其特征是，該亞丁基苯酞的代謝前驅(qū)物是3-亞丁 基-4, 5-二氫苯酞。6. 根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其特征是，該藥劑更包含橄欖油作為載劑。7. 根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的用途，其特征是，該藥劑用于延緩或避免小腦中浦肯 野細(xì)胞死亡。8. 根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的用途，其特征是，該藥劑是呈以下劑型：口服、鼻腔 給藥、靜脈注射、皮下或組織間緩釋。9. 根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的用途，其特征是，該藥劑是用于增加浦肯野細(xì)胞中蛋 白質(zhì)的泛素化作用。10. 根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的用途，其特征是，該藥劑是用于治療以下疾病及/ 或延緩其發(fā)病：脊髓性小腦萎縮癥、阿茲海默癥、帕金森氏癥、及前述的組合。11. 根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的用途，其特征是，該藥劑是用于治療脊髓性小腦萎 縮癥及/或延緩其發(fā)病。12. 根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的用途，其特征是，該藥劑是用于治療第三型脊髓性 小腦萎縮癥及/或延緩其發(fā)病。
【專利摘要】一種使用苯酞化合物（phthalide）于制備藥劑的用途，該藥劑特別是用以治療及／或延緩浦肯野細(xì)胞（Purkinjecells）退化，且該苯酞化合物是選自以下群組：亞丁基苯酞、亞丁基苯酞的代謝前驅(qū)物、亞丁基苯酞的代謝前驅(qū)物的醫(yī)藥可接受鹽、亞丁基苯酞的代謝前驅(qū)物的醫(yī)藥可接受酯、以及前述的任意組合。
【IPC分類】A61P25/28, A61P25/16, A61K31/365, A61P25/00
【公開號(hào)】CN105213370
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410322601
【發(fā)明人】林欣榮, 韓鴻志, 邱紫文, 吳政翰, 閻思尹
【申請(qǐng)人】長(zhǎng)弘生物科技股份有限公司
【公開日】2016年1月6日
【申請(qǐng)日】2014年7月8日
【公告號(hào)】US20160000751