Faecalibacterium prausnitzii HTF-F（DSM 26943）在抑制炎癥中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種藥物，特別涉及免疫學(xué)和胃腸病學(xué)。具體的，本發(fā)明涉及益生菌及 其提取物用于治療炎性失調(diào)（諸如炎性腸病和與微生物群失衡相關(guān)的疾?。┑闹委熡猛?。 本發(fā)明還提供了抗炎性（益生菌）組合物，例如功能性食物、營養(yǎng)物或藥物組合物，以及生 產(chǎn)它們的方法，以及促使腸道內(nèi)的益生菌生存的途徑。
【背景技術(shù)】
[0002] 炎性腸病（IBD)是胃腸道的慢性炎性失調(diào)，其特征有腹瀉、血便、腹痛和體重下 降。IBD是起因未知的慢性復(fù)發(fā)性炎癥。IBD包括兩種主要的病情：潰瘍性結(jié)腸炎（UC)和 克羅恩氏?。–rohn'sdisease，⑶）。UC主要影響大腸或結(jié)腸的粘膜層。相比之下，⑶ 被定義為透壁的肉芽腫性炎癥，可涉及小腸和大腸的幾段。UC和CD由在遺傳易感性宿主 體內(nèi)針對腸道微生物群的異常炎性T細(xì)胞應(yīng)答所驅(qū)動。微生物群在多樣性和組成中的極 al.2009)。在IBD患者的排泄物微生物群中已經(jīng)觀察到擬桿菌門（Bacteroidetes)和厚壁 菌門的出現(xiàn)率降低，而變形菌門和放線菌門的出現(xiàn)率增加（Frank，StAmandetal. 2007)。 尤其是，F(xiàn)aecalibacteriumprausnitzii(普氏奠桿菌），厚壁菌門中的一員并且是健康 人類結(jié)腸中最豐富的種類之一（Flint,Scottetal. 2012)，而在IBD患者的微生物群中 不足（Sokol，Seksiketal. 2009)。與緩解期患者體內(nèi)相比，來自回腸活檢的粘膜相關(guān)的 F.prauznitzii計數(shù)在患活動性疾病的⑶患者體內(nèi)較低（Sokol,Pigneuretal. 2008)。
[0003] 據(jù)報道，F(xiàn).prausnitzii是抗炎性細(xì)菌，因為它具有誘導(dǎo)人類外周血單核細(xì) 胞（PBMC，（Sokol,Pigneuretal.2008))中大量的IL-10以及樹突細(xì)胞的能力。進一 步地，據(jù)報道，使用F.prausnitzii的培養(yǎng)上清液處理Caco-2細(xì)胞降低了IL-1 0誘導(dǎo) 的NF-kB的活化和IL-8的分泌。這歸功于分泌到培養(yǎng)基中的一種還未被鑒定出的因子 (Sokol,Pigneuretal.2008)。此外，已經(jīng)不出給予F.prausnitzii菌株A2-165 及其培養(yǎng) 上清液，可在小鼠中預(yù)防2, 4, 6-三硝基苯磺酸（TNBS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎（Sokol,Pigneuret al. 2008)。這一模型被認(rèn)為與⑶類似，因為所產(chǎn)生的粘膜性炎癥在IFN-y、TNF-a和IL-12 的過量產(chǎn)生下由1型T輔助細(xì)胞（Thl)應(yīng)答介導(dǎo)。
[0004] 本發(fā)明人認(rèn)識到，需要更多的F.prausnitzii菌株用于炎性失調(diào)的預(yù)防和/或治 療中。他們的目的特別在于鑒定一種比在現(xiàn)有技術(shù)中使用的菌株A2-165(DSMZ17677)更 有效的菌株。進一步的目標(biāo)是提供具有抗炎性特性的細(xì)菌提取物。為了實現(xiàn)這一目的，評 價了F.prausnitzii的不同菌株及其提取物在小鼠葡聚糖硫酸鈉（DSS)結(jié)腸炎模型中抑制 炎癥的能力。
[0005] 令人驚奇的是，發(fā)現(xiàn)F.prausnitzii菌株HTF-F的活細(xì)胞以及在其中分離的細(xì)胞 外聚合物基質(zhì)（EPM)具有很強的免疫調(diào)節(jié)性質(zhì)。申請人于2013年3月1日將該菌株保藏在 德國微生物菌種保藏中心（DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturen， DSMZ)，登記號為DSM26943。之前，菌株HTF-F作為從健康人類供體獲得的幾種新的分離 物之一已經(jīng)在Lopez-Silesetal. (2012)中已經(jīng)進行了報道?；趯?6SrRNA的序列分 析，發(fā)現(xiàn)它屬于遺傳譜系II。但是，在本領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)中還沒有報道或暗示菌株HTF-F的 治療應(yīng)用，更不用說它在IBD中具有很強的抗炎性效果了。
[0006] 重要的是，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)HTF-F的抗炎性效果比菌株A2-165更有效，這部分是因為 HTF-F的EPM的免疫調(diào)節(jié)性質(zhì)。EPM的免疫調(diào)節(jié)效果至少部分通過在抗原遞呈細(xì)胞中產(chǎn)生 細(xì)胞因子IL-12和IL-10的TLR2依賴性調(diào)節(jié)來介導(dǎo)。還觀察到，菌株HTF-F進行細(xì)胞間聚 集并且在液體培養(yǎng)基中形成致密的生物膜，而菌株A2-165不會。不希望受到理論束縛的情 況下，生物膜可為體內(nèi)的細(xì)菌定植提供一些優(yōu)勢。尤其是，EPM可保護細(xì)菌免受氧化應(yīng)激， 因此可存在于靠近腸道上皮處，而腸道上皮是經(jīng)由其向內(nèi)擴散的氧的主要來源，優(yōu)于產(chǎn)生 較少EPM的菌株。這會幫助在接近結(jié)腸壁處遞送丁酸鹽和其它抗炎性產(chǎn)物。所有這些特征 使得F.prausnitzii菌株HTF-F成為強有力的益生菌，以治療結(jié)腸炎和其它炎性腸道疾病。 因此，F(xiàn).prausnitziiHTF-F及其EPM都有利地用于處置IBD和相關(guān)的炎性疾病中的治療。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 相應(yīng)地，在一個實施方式中，本發(fā)明提供了一種組合物，該組合物包括作為活性成 分的Faecalibacteriumprausnitzii菌株HTF-F或其含有細(xì)胞外聚合物基質(zhì)的提取物，和 可接受的載劑、稀釋劑或賦形劑。該組合物，例如，是藥物組合物、食物組合物或營養(yǎng)物組合 物。本發(fā)明還提供用作藥劑的F.prausnitzii菌株HTF-FDSM26943 (下文也稱作"HTF-F"） 和/或其含有細(xì)胞外聚合物基質(zhì)的提取物。例如，HTF-F或含有細(xì)胞外聚合物基質(zhì)的HTF-F 提取物有利地用于治療或預(yù)防哺乳動物受試者胃腸道的炎性失調(diào)的方法中。這在下文中例 示為小鼠結(jié)腸炎模型中的臨床參數(shù)的減小。
[0008] 本發(fā)明還提供了一種治療或預(yù)防與哺乳動物受試者的胃腸道炎性失調(diào)相關(guān)的癥 狀的方法，該方法包括給予有效量的Faecalibacteriumprausnitzii菌株HTF-F或其含有 EPM的提取物。
[0009] 根據(jù)本發(fā)明，F(xiàn)aecalibacteriumprausnitzii菌株可以是存活細(xì)胞的形式?；蛘?， 它們是非存活細(xì)胞的形式。還設(shè)想是存活細(xì)胞和非存活細(xì)胞的混合物。通常益生菌以存活 細(xì)胞的形式使用。但是，也可延伸至非存活細(xì)胞，諸如被殺死的培養(yǎng)物或含有由益生菌表達 的有益因子的組合物。這可包括熱殺死的微生物，或通過暴露于改變的pH或經(jīng)壓力或Y 輻照殺死的微生物。細(xì)胞可被加入到藥物中。與存活細(xì)胞相比，使用非存活的細(xì)胞，特別在 考慮到它的氧敏性時，產(chǎn)品制備更加簡單且儲存需求的限制少很多。
[0010] 在具體的方面，例如通過直腸內(nèi)遞送，將活的細(xì)菌或EPM直接給予到胃腸道內(nèi)。 非細(xì)菌遞送的其它選擇包括不依賴于腸道的途徑，包括系統(tǒng)性遞送（諸如通過腹腔內(nèi)注 射）。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，細(xì)菌的一種或多種經(jīng)純化的、不會在宿主細(xì)胞內(nèi)引發(fā)炎 性應(yīng)答的抗炎性組分例如，經(jīng)口、皮下或局部地給藥。
[0011] 考慮到它的強抗炎性效果，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)它在涉及不想要的炎性應(yīng)答的各種病理學(xué) 中的應(yīng)用。炎癥可被歸類為急性炎癥或慢性炎癥。急性炎癥是身體對有害刺激的初始應(yīng)答， 并且通過增強血漿和白血球（特別是粒細(xì)胞）從血液中向受傷組織中的移動來實現(xiàn)。生化 事件的一系列步驟傳送了炎性應(yīng)答并且使其成熟，這涉及局部脈管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和在受 傷組織內(nèi)的各種細(xì)胞。長期炎癥（也稱為慢性炎癥）導(dǎo)致在炎癥位點處存在的細(xì)胞類型發(fā) 生漸進式改變，并且特征是來自炎性過程的組織同時發(fā)生破壞和愈合。
[0012] 在一個實施方式中，炎性疾病是炎性腸胃失調(diào)，優(yōu)選選自由炎性腸病、克羅恩 氏病、腸易激綜合征、潰瘍性結(jié)腸炎、乳糜瀉、感染性結(jié)腸炎（例如由艱難梭狀芽孢桿菌 (C.difficile)引起）、潰瘍性結(jié)腸炎、其它腸道相關(guān)疾病，及它們的任意組合組成的組?；?者，炎性疾病是炎性自身免疫性疾病，其中異型性增生-平衡的微生物群和低級的粘膜炎 癥與疾病（諸如糖尿?。↖型和II型）、哮喘和特應(yīng)性疾?。┑牟≡瓕W(xué)或發(fā)作相關(guān)。
[0013] 在另一方面，菌株HTF-F和包含它們的組合物用作患有與腸道微生物群失衡相關(guān) 的癥狀或失調(diào)，或具有發(fā)展成這些癥狀或失調(diào)的風(fēng)險增加的人的預(yù)防性或治療性試劑。腸 道微生物群組成已與代謝綜合征（例如肥胖、II型糖尿病、心血管疾病和非酒精性脂肪性 肝炎）的幾個標(biāo)志相關(guān)聯(lián)。越來越多的證據(jù)表明，腸道微生物群促使低級炎癥的發(fā)作，該低 級炎癥的特征是經(jīng)由與腸道屏障功能障礙相關(guān)的機制引起這些代謝失調(diào)。目前，已經(jīng)示出， 腸內(nèi)分泌細(xì)胞和內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)控制腸道通透性和代謝性內(nèi)毒素血癥。而且，在此背景 下使用具有益生元性質(zhì)的不易消化的碳水化合物的定向營養(yǎng)干預(yù)已經(jīng)在臨床前研究中示 出了有希望的結(jié)果，盡管人類干預(yù)研究是進一步研究的根據(jù)。因此，本發(fā)明的組合物有利地 用于建立或維持平衡的腸道微生物群。進一步地，在肥胖和II型糖尿病的背景下，HTF-F可 用于改變作為治療靶點的腸道微生物群。
[0014] 人們越來越認(rèn)識到腸道微生物群與能量穩(wěn)態(tài)和炎癥及其在肥胖相關(guān)失調(diào)的發(fā)病 機理中的作用之間的關(guān)系。肥胖動物模型將改變的微生物群組成通過以下幾種機制與宿主 體內(nèi)的肥胖的發(fā)展、胰島素耐受性和糖尿病關(guān)聯(lián)起來：由飲食增加的能量收集，脂肪組織和 肝臟中的改變的脂肪酸代謝和組成，腸肽YY和胰高血糖素樣肽（GLP) -1分泌的調(diào)節(jié)，脂多 糖toll樣受體4軸的活化，以及GLP-2對腸道屏障完整性的調(diào)節(jié)。
[0015] 在優(yōu)選的實施方式中，菌株HTF-F或其含有抗炎性試劑的提取物用于保護大腸或 結(jié)腸的粘膜層或治療對大腸或結(jié)腸的粘膜層所造成的傷害。
[0016] 優(yōu)選地，要經(jīng)受治療的受試者是人類受試者，例如是已知患有或懷疑患有潰瘍性 結(jié)腸炎的人類受試者。但是，本發(fā)明還可應(yīng)用于獸醫(yī)學(xué)。例如，還可提供Feacalibacterium prausnitzii菌株HTF-F或其提取物用于家畜或農(nóng)畜的治療應(yīng)用。
[0017] F.prausnitzii菌株HTF-F或其提取物優(yōu)選增加受試者體內(nèi)抗炎性細(xì)胞因子的產(chǎn) 生，和/或減少受試者體內(nèi)一種或多種促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生。例如，抗炎性細(xì)胞因子是 IL-10或TGFP。在一個實施方式中，促炎性細(xì)胞因子依賴于TLR2信號傳導(dǎo)，所述細(xì)胞因子 優(yōu)選是IL-12p70。
[0018] 我們還描述F.prausnitzii菌株HTF-F或其提取物用于制備預(yù)防和/或治療不期 望的炎癥活性的抗炎性生物治療試劑，或用于制備預(yù)防和/或治療不期望的炎癥活性的抗 炎性生物治療試劑。所述菌株可通過對抗來自胃腸道的促炎性微生物和從胃腸道排除促炎 性微生物來起作用。
[0019] 細(xì)菌或提取物經(jīng)配制，以治療有效量給予受試者，這依賴于例如受試者的類型、疾 病嚴(yán)重程度和給藥途徑。典型地，細(xì)菌的治療有效量是約10exp6CFU/天至lOexpllCFU/天， 優(yōu)選 10exp7CFU/ 天至lOexplOCFU/ 天。
[0020] 可經(jīng)由任何適當(dāng)?shù)慕o藥途徑給予細(xì)菌。例如，可以經(jīng)口攝取的形式將本發(fā)明的特 定的Faecalibacteriumprausnitzii菌株給予動物（包括人類）。在食物組合物或營養(yǎng)物 的情況中，細(xì)菌可簡單地添加到傳統(tǒng)食品（fooditem)或食物補充劑中。示例性的藥物制 劑包括膠囊、微囊劑、片劑、顆粒劑、粉劑、錠劑、丸劑、栓劑、混懸劑和糖漿劑。在另一實施方 式中，所述組合物是向動物（包括人類）進行直腸給藥的形式，例如作為直腸栓劑或灌腸 劑。適當(dāng)?shù)闹苿┛赏ㄟ^使用常規(guī)有機和無機添加劑的通常采用的方法來制備。藥物組合物 中的活性成分的量可為顯示出期望治療效果的水平。
[0021] 所述組合物可含有任何有用的其它成分，諸如已知支持有益細(xì)菌的生長或維持， 以便以有益的方式改變胃腸微生物群落的成分。這樣的成分被稱為"益生元"。已知的益生 元的典型實例是低聚糖，諸如低聚果糖和菊粉。合生素指：以協(xié)同的方式將益生菌和益生元 組合在一起的營養(yǎng)補充劑。
[0022] 上述抗炎性效果所需的F.prausnitzii細(xì)菌對氧極度敏感，并且在暴露于環(huán)境空 氣超過幾分鐘就不能存活下來。因此，迄今為止，除了它們的有希望的治療應(yīng)用外，還沒有 描述含有存活的F.prausnitzii的益生菌組合物。
[0023] 本發(fā)明的具體方面涉及一種合生素組合物，該合生素組合物包含與以下物質(zhì)混合 的Faecalibacteriumprausnitzii菌株HTF-F:核黃素、核黃素磷酸鹽或其生理學(xué)上可接 受的鹽，和半胱氨酸。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)上述混合物令人驚奇地使這些細(xì)菌在制造、儲存和/或消 耗的過程中暴露于環(huán)境空氣時受到很好的保護。例如，它可經(jīng)受環(huán)境空氣暴露達至少24h， 并且在模擬的胃腸液中穩(wěn)定達至少2h。而且，當(dāng)與食品（例如奶或乳酸菌飲料）混合時，本 發(fā)明的合生素制劑可穩(wěn)定至少2h。優(yōu)選使用核黃素。
[0024] 基于所述組合物的總干重，核黃素、核黃素磷酸鹽或其生理上可接受的鹽以至少 0.05%、優(yōu)選至少1%、更優(yōu)選至少2%的量存在。例如，基于所述組合物的總干重，可含有 0.05%至10%、優(yōu)選1%~10%，如2%~10%或0.05%~0.25%。基于所述組合物的總 干重，半胱氨酸優(yōu)選以至少0.05%的量存在。適于使用高至2%的半胱氨酸含量。例如，基 于所述組合物的總干重，所述組合物可含有0. 1%~1.5%、0. 5%~1%或0.05%~0.2% 的半胱氨酸。
[0025] 所述組合物可進一步包含一種或多種益生元，優(yōu)選低聚糖，更優(yōu)選低聚果糖、果膠 和/或菊粉或菊粉型低聚果糖，它們的量優(yōu)選是基于所述組合物的總干重的2%~10%。其 它適當(dāng)?shù)某煞职ㄌ畛鋭?，該填充劑的量?yōu)選是基于所述組合物的總干重的40%~65%。
[0026] 當(dāng)然，所述組合物可含有其它有用的成分，包括其它益生元和/或益生菌。有 用的益生菌優(yōu)選選自由乳酸菌、雙歧桿菌或其混合物組成的組。益生菌可以是具有已證 實的益生菌特征的任何乳酸菌或雙歧桿菌。例如，它們還可促進雙歧桿菌腸道微生物群 的發(fā)展。在一些情況中，它們還可輔助保護F.prausnitzii免受氧的影響。適當(dāng)?shù)钠渌?益生菌可選自