治療代謝紊亂的方法
【專利說明】治療代謝紊亂的方法
[0001] 政府資助
[0002] 本發(fā)明是在由國立衛(wèi)生研究院授予的批準號HL097738和DK077086下借助政府資 助完成。政府對本發(fā)明具有一定的權(quán)利。
[0003] 以引用的方式并入電子提交材料
[0004] 本申請含有呈計算機可讀形式的序列表（文件名：46768S_SeqListing.txt;2014 年3月18日創(chuàng)建；3, 026字節(jié)-ASCII文本文件），所述序列表作為本公開內(nèi)容的單獨部分， 以引用的方式整體并入。 發(fā)明領(lǐng)域
[0005] 本發(fā)明涉及治療以神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白4(Nrg4)缺陷為特征的病狀（如代謝紊亂）的方 法。
[0006] 背景
[0007] 代謝綜合征已經(jīng)成為全球流行病，其顯著增加了患2型糖尿病、心血管疾病和非 酒精性脂肪肝?。∟AFLD)的風(fēng)險。在胰島素抵抗中，升高的肝葡萄糖產(chǎn)生和脂蛋白分泌促 成高血糖癥和高脂血癥的發(fā)病機理。肥胖癥也與過量脂肪在肝臟中的累積相關(guān)，過量脂肪 在肝臟中的累積是影響成年人和孩子的NAFLD的最典型特征。雖然肝脂肪變性通常作為對 肝功能沒有明顯的不良效應(yīng)的良性病狀出現(xiàn)，但是在20% -30%的患有非酒精性脂肪性肝 炎（NASH)的NAFLD患者中觀察到進行性肝損傷、炎癥和纖維化。NASH正在成為終末期肝 病的主要危險因素。控制肝葡萄糖和脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)已經(jīng)成為過去二十年中的研究焦 點。這些研究為促成葡萄糖和脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的分子和生理機制提供了關(guān)鍵性的認識。然而，介 導(dǎo)不同組織間（尤其是在脂肪組織和肝臟之間）的串擾的激素線索仍然難以確定。
[0008] 神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白（NRG)為含有保守的表皮生長因子（EGF)樣結(jié)構(gòu)域的生長因子的家 族。至今，已經(jīng)在哺乳動物中鑒定了 4種神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白基因（Nrgl-4)，所述基因通過廣泛 的選擇性剪接產(chǎn)生一系列多樣化的信號傳導(dǎo)配體。NRG通常被合成為經(jīng)受蛋白水解裂解以 釋放含有EGF樣結(jié)構(gòu)域的細胞外片段的跨膜蛋白。基因和生物化學(xué)的研究證明了NRG通過 酪氨酸激酶受體的ErbB家族發(fā)出信號并且以旁分泌、自分泌和內(nèi)分泌的方式發(fā)揮它們的 生物效應(yīng)。在神經(jīng)肌肉系統(tǒng)的發(fā)育中Nrgl已經(jīng)被廣泛地表征，尤其是在神經(jīng)肌肉突觸和外 周神經(jīng)中。此外，在維持心臟的穩(wěn)態(tài)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中Nrgl起著重要的作用。Nrgl 和Nrg3的遺傳多態(tài)性已分別與精神分裂癥和先天性巨結(jié)腸疾?。℉irschsprungDisease) 的風(fēng)險相關(guān)。NRG令人驚奇地引發(fā)靶細胞中的特異性生物應(yīng)答。Nrg4基于它的序列與其它 NRG成員具有同源性而被發(fā)現(xiàn)并且預(yù)測其編碼115個氨基酸的前體蛋白。介導(dǎo)Nrg4對尤其 是葡萄糖和脂質(zhì)代謝和NAFLD的生物效應(yīng)的相關(guān)細胞受體還未確定。
[0009] 前述觀察結(jié)果提供了仍然需要在治療疾病如2型糖尿病、心血管疾病和非酒精性 脂肪肝疾?。∟AFLD)中有用的組合物和制劑的證據(jù)。
[0010] 概述
[0011] Nrg4被鑒定為靶向肝臟中的肝細胞的脂肪細胞源性因子。在肥胖癥的小鼠模型 中，Nrg4在脂肪組織中的表達明顯減少。使用Nrg4敲除的小鼠，確定了Nrg4缺陷使飲食 誘導(dǎo)的高血糖癥、高血脂癥和肝脂肪變性加劇。相反，Nrg4的脂肪-特異性轉(zhuǎn)基因表達使 在高脂食物喂養(yǎng)之后這些代謝參數(shù)顯著提高。合起來，這些研究鑒定Nrg4為用于生物治療 劑的開發(fā)的新型靶標，從而用于治療2型糖尿病、高血脂癥和NAFLD。
[0012] 在本公開的一個方面中，提供了治療代謝紊亂的方法，所述方法包括向有需要的 患者施用治療有效量的Nrg4、Nrg4變體或其生物學(xué)活性片段。
[0013] 在一些實施方案中，代謝紊亂選自由以下各項組成的組：非酒精性脂肪肝病 (NAFLD)、脂肪性肝炎、II型糖尿病、高血糖癥、高血脂癥、血脂異常、肥胖癥、高胰島素血癥、 胰島素抵抗、高膽固醇血癥、非家族性高膽固醇血癥、家族性高膽固醇血癥、雜合型家族性 高膽固醇血癥、純合型家族性高膽固醇血癥、混合型血脂異常、動脈粥樣硬化、早發(fā)型?冠心 病、血脂異常、高甘油三酯血癥、高脂肪酸血癥和肝硬化。
[0014] 在一些實施方案中，生物學(xué)活性片段包括SEQIDN0:1的殘基5-46、5-55、5-62、 1-46、1-55、1-52、1-53、4-52、4-53 或 1-62。
[0015]在一些實施方案中，Nrg4 變體與SEQIDN0:1 至少 70 %、75 %、80 %、85 %、90 %、 95%或99%相同。
[0016] 在一些實施方案中，Nrg4、Nrg4變體或其生物學(xué)活性片段由病毒載體編碼。
[0017] 在一些實施方案中，Nrg4、Nrg4變體或其生物學(xué)活性片段是經(jīng)化學(xué)合成的或從重 組來源中純化得到的。
[0018] 在本公開的另一個方面中，提供了治療以神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白4(Nrg4)缺陷為特征的疾 病或病狀的方法，該方法包括向有需要的患者施用治療有效量的Nrg4(SEQIDNO: 1)、Nrg4 變體或其生物學(xué)活性片段。
[0019] 在一些實施方案中，所述疾病或病狀為與來自健康患者的脂肪組織中的NRG4的 表達相比，脂肪組織中的NRG4的表達減少。在一些實施方案中，脂肪組織為褐色脂肪組織 或白色脂肪組織。
[0020] 在一些實施方案中，所述疾病或病狀為脂肪細胞和人體組織之間的異常交流。
[0021] 在一些實施方案中，所述疾病或病狀為代謝紊亂。在一些實施方案中，代謝紊亂選 自由以下各項組成的組：非酒精性脂肪肝?。∟AFLD)、脂肪性肝炎、II型糖尿病、高血糖癥、 尚血脂癥、血脂異常、肥胖癥、尚膜島素血癥、膜島素抵抗、尚膽固醇血癥、非家族性尚膽固 醇血癥、家族性高膽固醇血癥、雜合型家族性高膽固醇血癥、純合型家族性高膽固醇血癥、 混合型血脂異常、動脈粥樣硬化、早發(fā)型冠心病、血脂異常、高甘油三酯血癥、高脂肪酸血癥 和肝硬化。
[0022] 在一些實施方案中，生物學(xué)活性片段包括SEQIDN0:1的殘基5-46、5-55、5-62、 1-46、1-55、1-52、1-53、4-52、4-53 或 1-62。
[0023]在一些實施方案中，Nrg4 變體與SEQIDN0:1至少70%、75%、80%、85%、90%、 95%或99%相同。
[0024] 在一些或任何實施方案中，Nrg4、Nrg4變體或其生物學(xué)活性片段由病毒載體編碼。
[0025] 在一些實施方案中，Nrg4、Nrg4變體或其生物學(xué)活性片段是經(jīng)化學(xué)合成的或從重 組來源中純化得到的。
[0026]在本公開的另一個方面中，提供了治療選自由以下各項組成的組的病狀的方法： 非酒精性脂肪肝病（NAFLD)、脂肪性肝炎、II型糖尿病、高血糖癥、高血脂癥、血脂異常、肥 胖癥、高胰島素血癥、胰島素抵抗、高膽固醇血癥、非家族性高膽固醇血癥、家族性高膽固醇 血癥、雜合型家族性高膽固醇血癥、純合型家族性高膽固醇血癥、混合型血脂異常、動脈粥 樣硬化、早發(fā)型冠心病、血脂異常、高甘油三酯血癥、高脂肪酸血癥和肝硬化，該方法包括 向有需要的患者施用治療有效量的Nrg4、Nrg4變體或其生物學(xué)活性片段。在一些實施方 案中，生物學(xué)活性片段包括SEQIDN0:1的殘基5-46、5-55、5-62、1-46、1-55、1-52、1-53、 4-52、4-53或1-62。在一些實施方案中，Nrg4變體與SEQIDNO: 1至少70%、75%、80%、 85%、90%、95%或99%相同。
[0027] 在本公開的又一個方面中，提供了減少肝臟中脂肪累積的方法，該方法包括向有 需要的患者施用治療有效量的Nrg4、Nrg4變體或其生物學(xué)活性片段。在一些實施方案中， Nrg4、Nrg4變體或其生物學(xué)活性片段與治療有效量的降脂劑共同施用。在一些實施方案中， 降脂劑選自由以下各項組成的組：阿托伐他?。╝torvastatin)、辛伐他?。╯imvastatin)、 羅素伐他?。╮osuvastatin)、氟伐他?。╢luvastatin)、依澤替米貝（ezetimibe)、苯扎貝 特（bezafibrate)、環(huán)丙貝特（ciprofibrate)、安妥明（clofibrate)、煙酸（niacin)、吉非 羅齊（gemfibrozil)和非諾貝特（fenofibrate)。
[0028] 而在本公開的又一個方面中，提供了降低血糖水平的方法，該方法包括向有需要 的患者施用治療有效量的Nrg4、Nrg4變體或其生物學(xué)活性片段。在一些實施方案中，Nrg4、 Nrg4變體或其生物學(xué)活性片段與治療有效量的胰島素、GLP-1、二甲雙胍或DPP4抑制劑共 同施用。
[0029] 而在本公開的又一個方面中，提供了藥物組合物，該藥物組合物包含Nrg4、Nrg4 變體或其生物學(xué)活性片段以及藥學(xué)可接受的載體。在一些實施方案中，生物學(xué)活性片段包 括SEQIDN0:1 的殘基 5-46、5-55、5-62、1-46、1-55、1-52、1-53、4-52、4-53或1-62。在一 些實施方案中，Nrg4 變體與SEQIDN0:1 至少 70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%相 同。
[0030] 而在另一個本公開的方面中，提供了診斷測試個體中的代謝紊亂的方法，該方法 包括測定來自測試個體的樣品中的Nrg4水平的步驟，其中與正常個體中的Nrg4水平相比， 測試個體中降低的Nrg4水平是病狀的提示，并且其中已知正常個體沒有罹患代謝紊亂。
[0031] 在另一個本公開的方面中，提供了用于診斷個體中代謝紊亂的方法，該方法包括 檢測來自個體的樣品中的Nrg4水平的步驟，其中與同一個體中之前的Nrg4水平相比，降低 的Nrg4水平是代謝紊亂的提示。
[0032] 在另一個本公開的方面中，提供了用于測定測試個體中對代謝紊亂的易感性的方 法，該方法包括測定來自測試個體的樣品中的Nrg4水平的步驟，其中與來自正常個體的樣 品中的Nrg4水平相比，測試個體中降低的Nrg4水平指示對病狀的易感性，并且其中已知正 常個體沒有罹患代謝紊亂。
[0033] 在另一個本公開的方面中，提供了用于測定個體中對代謝紊亂的易感性的方法， 該方法包括檢測來自個體的樣品中的Nrg4水平的步驟，其中與同一個體中之前的Nrg4水 平相比，個體中降低的Nrg4水平是對代謝紊亂的易感性的提示。
[0034] 在另一個本公開的方面中，提供了用于測定個體中代謝紊亂的進展的方法，該方 法包括測定來自個體的樣品中的隨著時間的Nrg4水平的步驟，其中Nrg4水平隨著時間的 減少是代謝紊亂的進展的提示。
[0035] 在另一個本公開的方面中，提供了用于監(jiān)測個體中代謝紊亂的治療有效性的方 法，該方法包括測定來自個體的樣品中的隨著時間的Nrg4水平的步驟，其中Nrg4水平隨著 時間的增加是有效治療的提示。
[0036] 在段落[0018]_[0023]的方法的一些實施方案中，代謝紊亂選自由以下各項組成 的組：非酒精性脂肪肝?。∟AFLD)、脂肪性肝炎、II型糖尿病、高血糖癥、高血脂癥、血脂異 常、肥胖癥、高胰島素血癥、胰島素抵抗、高膽固醇血癥、非家族性高膽固醇血癥、家族性高 膽固醇血癥、雜合型家族性高膽固醇血癥、純合型家族性高膽固醇血癥、混合型血脂異常、 動脈粥樣硬化、早發(fā)型冠心病、血脂異常、高甘油三酯血癥、高脂肪酸血癥和肝硬化。
[0037] 在以上方法的一些實施方案中，Nrg4水平是Nrg4的血清蛋白濃度的量度。
[0038] 在一些實施方案中，Nrg4水平是NRG4mRNA水平的量度。
[0039] 在一些實施方案中，Nrg4水平是Nrg4活性的量度。
[0040] 在一些實施方案中，Nrg4活性是特異性結(jié)合活性。
[0041] 在另一個方面中，本公開包括使用Nrg4來制備藥劑。在另一個方面中，本公開包 括使用Nrg4和包含Nrg4的組合物來治療NAFLD、脂肪性肝炎、II型糖尿病、高血糖癥、高血 脂癥、血脂異常、肥胖癥、高胰島素血癥、胰島素抵抗、高膽固醇血癥、非家族性高膽固醇血 癥、家族性高膽固醇血癥、雜合型家族性高膽固醇血癥、純合型家族性高膽固醇血癥、混合 型血脂異常、動脈粥樣硬化、早發(fā)型冠心病、血脂異常、高甘油三酯血癥、高脂肪酸血癥和肝 硬化。在本公開中還提供其它相關(guān)方面。
[0042] 從以下的詳細描述中將會明了本公開的其它特點和優(yōu)點。然而，應(yīng)理解的是，雖然 詳細描述和具體實施例示出本公開的優(yōu)選實施方案，但它們僅通過說明的方式給出，這是 因為本領(lǐng)域技術(shù)人員從這一詳細描述中將會明了在本公開的精神和范圍內(nèi)的各種變化和 修改。
[0043] 附圖簡述
[0044]圖1:人和小鼠的Nrg4蛋白質(zhì)序列的比對。EGF樣結(jié)構(gòu)域的特征為存在三個保守 的二硫鍵（細線連接半胱氨酸殘基）。推定的N-連接糖基化位點（N39YT)、蛋白水解裂解位 點（箭頭）和預(yù)測的跨膜結(jié)構(gòu)域（TM)被指出。應(yīng)注意到人和小鼠的Nrg4的EGF樣結(jié)構(gòu)域 (氨基酸1至大約氨基酸52)是高度保守的。
[0045] 圖2 :Nrg4在脂肪組織和培養(yǎng)的脂肪細胞中的表達。⑷在不同組織中的Nrg4 mRNA的Taqman定量PCR分析。Nrg4在褐色脂肪組織（BAT)和白色脂肪組織（WAT)中被大 量地表達。分析來自三只C57BL/6J雄性小鼠的混合的RNA樣本。（B)在褐色（頂部）和白 色（3T3-L1，底部）脂肪細胞的分化過程中誘導(dǎo)Nrg4mRNA表達。包括了作為分化標記的 UCP1和PPARy。示出了來自一個代表性研究的三個復(fù)孔的平均值土標準差。
[0046] 圖3 :Nrg4缺陷的小鼠具有低溫耐受性并且具有正常的低溫誘導(dǎo)的生熱作用。（A) 野生型和Nrg4K0小鼠在低溫暴露之后的直腸溫度。在自由獲取食物和水的情況下將小鼠 從環(huán)境溫度轉(zhuǎn)移至4°C持續(xù)共4小時。（B)肩胛間的褐色脂肪組織的組織學(xué)（H&E)(比例尺 =100ym)。（C)對暴露在環(huán)境溫度（室溫，WT= 5,K0 = 6)或低溫溫度（低溫，WT= 5， K0 = 7)的小鼠中的BAT基因表達的qPCR分析。（D)在低溫暴露之后的WT和Nrg4K0小 鼠中的血漿甘油三酯（TG)、酮（0-羥基丁酸）和非酯化脂肪酸（NEFA)的濃度。
[0047] 圖4 :Nrg4的EGF樣結(jié)構(gòu)域與肝細胞結(jié)合。⑷分泌的堿性磷酸酶（SEAP)對照或 SEAP-Nrg4融合蛋白（氨基酸1-62)的示意圖。（B)SEAP-Nrg4N62特異性地與肝細胞結(jié)合， 但并不與BAT、心臟、肌肉和脾臟中的細胞結(jié)合。（C)過量的GST-Nrg4N62融合蛋白競爭存在 肝細胞上的Nrg4結(jié)合位點。在3.Og/mLGST或GST-Nrg4重組蛋白存在下將SEAP-Nrg4N62 與肝切片一起孵育。
[0048] 圖5 :通過肥胖調(diào)節(jié)脂肪Nrg4表達。（A)來自瘦的或飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠的WAT 和BAT中的Nrg4mRNA水平的qPCR分析。野生型C57BL/6J雄性小鼠保持進食標準食物（n =5)或高脂食物（n= 6)3個月。將總RNA從脂肪組織分離以用于qPCR分析。（B)來自 WT(n= 5)或瘦素受體缺陷db/db(n= 6)小鼠的脂肪組織中的Nrg4mRNA水平的qPCR分 析。A-B中的數(shù)據(jù)為平均值土SEM。\〈0.05。（C)從來自被喂養(yǎng)標準食物（n= 3)或高脂 食物（n= 3)的小鼠的附睪的WAT分離的基質(zhì)血管成分（SVF)和脂肪細胞成分中的Nrg4 mRNA水平的qPCR分析。*p〈0. 01標準食物對比HFD。（D)在用媒介物（_)或TNFa(l〇ng/ mL)處理所指示的時間的成熟3T3-L1脂肪細胞中的Nrg4表達。示出了來自一個代表性研 究的三個復(fù)孔的平均值土標準差。"^〈O.OITNFa對比媒介物。
[0049] 圖6 :Nrg4表達水平和代謝參數(shù)之間的相關(guān)性。具有54只野生型C57BL/6J雄 性小鼠的組被喂養(yǎng)高脂食物2個月。檢測附睪的WAT中的相對Nrg4mRNA表達和代謝參 數(shù)。（A-B)Nrg4mRNA表達與體重負相關(guān)（A)并且與附睪的白色脂肪重量負相關(guān)（B)。（C) 高Nrg4 (下框）和低Nrg4 (上框）表達水平分別與低血糖水平和高血糖水平相關(guān)。（D)高 Nrg4(下框）和低Nrg4(上框）表達水平分別與低肝脂肪含量和高肝脂肪含量相關(guān)。
[0050] 圖7 :Nrg4缺陷使飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗和高血脂癥加劇。⑷被喂養(yǎng)標準食物或 高脂食物（HFD)的野生型（填充的，n= 8)和Nrg4K0(灰白的，n= 9)小鼠的體重。在HFD 喂養(yǎng)之后的8周檢測血漿瘦素水平。（B)在喂養(yǎng)和禁食條件下檢測血漿葡萄糖和胰島素水 平。（C)甘油三酯、總膽固醇和0 -羥基丁酸的血漿濃度。數(shù)據(jù)代表平均值土SEM。\〈0. 05。
[0051] 圖8:Nrg4缺陷使飲食誘導(dǎo)的肝脂肪變性加劇。（A)在被喂養(yǎng)HFD7周的野生型 (填充的，n= 9)和Nrg4K0(灰白的，n= 8)小鼠中的肝甘油三酯含量。數(shù)據(jù)代表平均值 土SEM。*p〈0. 05。⑶來自HFD之后的7周的WT和Nrg4K0小鼠的附睪的WAT和肝切片的 H&E染色。比例尺=100yM。
[0052] 圖9:脂肪組織中Nrg4的轉(zhuǎn)基因表達使小鼠免受飲食誘導(dǎo)的代謝紊亂。（A)脂肪 特異性Nrg4轉(zhuǎn)基因小鼠（TG)免受飲食誘導(dǎo)的肥胖癥。（B)在8周的高脂喂