養(yǎng)之后的WT(n =10)和TG(n= 9)小鼠中的血漿瘦素濃度。（C)在WT和TG小鼠中的血漿葡萄糖（喂養(yǎng) 和禁食）、總膽固醇（喂養(yǎng)）和羥基丁酸（禁食）的濃度。A-C中的數(shù)據(jù)代表平均值 土SEM。*p〈0. 05。
[0053]圖10 :Nrg4轉(zhuǎn)基因小鼠具有更大的葡萄糖耐受性、胰島素敏感性并且免受飲食誘 導(dǎo)的脂肪肝。（A)在10周的高脂喂養(yǎng)之后的WT和TG小鼠中的葡萄糖耐受性測(cè)試。（B)在 12周的高脂喂養(yǎng)之后的WT和TG小鼠中的胰島素耐受性測(cè)試。A-B中的數(shù)據(jù)代表平均值 ±3已1(11 = 8-10)。>^〈0.05。（〇在被喂養(yǎng)冊(cè)0 11周的町（灰白的，11 = 9)和16(填充的， n= 9)小鼠中的肝甘油三酯含量。數(shù)據(jù)代表平均值土SEM。V〇. 〇5。⑶附睪的WAT和肝 切片的H&E染色。
[0054] 圖11:在11周的HFD喂養(yǎng)之后的WT和TG小鼠中的肝基因表達(dá)的qPCR分析。數(shù) 據(jù)代表平均值土SEM。*p〈0. 05。
[0055] 圖12:重組Nrg4使飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠中的血糖降低。HFD喂養(yǎng)的肥胖小鼠腹腔 內(nèi)注射GST或GST-Nrg4N62兩次（每克體重4yg)，持續(xù)共6小時(shí)。應(yīng)注意到Nrg4使血糖水 平降低，而并非通過(guò)促進(jìn)胰島素分泌。
[0056] 圖13:對(duì)Nrg4作為用于治療2型糖尿病和非酒精性脂肪肝病的潛在生物治療劑 的模型描繪。Nrg4為脂肪細(xì)胞源性激素，該激素作用于肝臟以降低血糖和脂質(zhì)，并且減少肝 脂肪含量。
[0057] 圖14:對(duì)釋放Nrg4的細(xì)胞外片段重要的氨基酸的繪制。SEAP-Nrg4融合載體在 SEAPcDNA和全長(zhǎng)Nrg4即氨基酸1-115之間被構(gòu)建并且瞬時(shí)被轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞中。在 免疫印跡上指出丙氨酸突變體的位置。收獲條件培養(yǎng)基和總細(xì)胞裂解物并且用抗-SEAP抗 體通過(guò)免疫印跡法分析。應(yīng)注意到氨基酸53-54或53的突變顯著地減少了融合蛋白向培 養(yǎng)基中的分泌。
[0058] 圖15 :在肥胖癥的小鼠模型中褐色和白色脂肪組織中的Nrg4的表達(dá)減少。㈧來(lái) 自瘦的（空白柱）或肥胖（黑柱）小鼠的附睪的白色脂肪（eWAT)和BAT中的Nrg4mRNA表 達(dá)的qPCR分析。對(duì)于DIO,WT雄性小鼠被喂養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)食物（n= 5)或HFD(n= 6) 3個(gè)月。對(duì) 于遺傳型的肥胖癥，分析一組中的WT(n= 3)和ob/ob(n= 4)小鼠和一個(gè)單獨(dú)組中的WT(n =5)和db/db(n= 6)小鼠。（B)從來(lái)自瘦的（n= 3)或DI0(n= 3)小鼠的eWAT分離的 基質(zhì)血管成分（SVF)和脂肪細(xì)胞成分（Ad)中的Nrg4mRNA表達(dá)的qPCR分析。a-b中的數(shù) 據(jù)代表平均值土s.e.m。*p〈0. 05。（C)在用媒介物（Veh)、TNFa(l〇ng/ml)或IL1 0 (40ng/ ml)處理6小時(shí)之后的已分化的褐色或3T3-L1脂肪細(xì)胞中的Nrg4mRNA表達(dá)的qPCR分析。 數(shù)據(jù)代表來(lái)自一個(gè)進(jìn)行三次重復(fù)的代表性研究的平均值土標(biāo)準(zhǔn)差。\〈〇.05對(duì)比Veh。
[0059] 圖16:Nrg4缺陷使飲食誘導(dǎo)的肥胖癥加劇并且升高血漿甘油三酯水平。（A)被喂 養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)食物或HFD的野生型（填充的，n= 8)和Nrg4K0(灰白的，n= 9)小鼠的體重、肥 胖和瘦體重的百分比。（B)在喂養(yǎng)和禁食條件下的WT和Nrg4K0小鼠中的血漿TAG水平。 (C)0-羥基丁酸的血漿濃度。數(shù)據(jù)代表平均值土SEM。*p〈0.05。
[0060] 圖17:Nrg4缺陷使飲食誘導(dǎo)的肝脂肪變性加劇。㈧在被喂養(yǎng)HFD7周的野生型 (填充的，n= 9)和Nrg4K0(灰白的，n= 8)小鼠中的肝甘油三酯含量。數(shù)據(jù)代表平均值 土SEM。*p〈0.05。（B)來(lái)自HFD之后7周的WT和Nrg4K0小鼠的BAT、附睪的WAT和肝切 片的H&E染色。比例尺=100yM。
[0061] 圖18:Nrg4缺失小鼠患有更嚴(yán)重的高脂食物誘導(dǎo)的葡萄糖的不耐受性和胰島素 抵抗。（A)在HFD喂養(yǎng)的WT和K0小鼠中的喂養(yǎng)和禁食的血糖以及禁食的血漿胰島素水平。 (B)在喂養(yǎng)HFD13周之后的WT(n= 7,填充的菱形，黑線）和Nrg4K0(n= 7,空白方塊，紅 線）小鼠中葡萄糖耐受性測(cè)試。（C)在喂養(yǎng)HFD15周之后的WT(n= 7)和Nrg4K0(n= 9)小鼠中的胰島素耐受性測(cè)試。數(shù)據(jù)代表平均值土s.e.m。\〈0. 05,K0對(duì)比WT。
[0062] 圖19:Nrg4缺陷促進(jìn)肝脂肪生成基因程序的異常激活。（A)自由進(jìn)食的WT和Nrg4 K0小鼠中的肝基因表達(dá)的qPCR分析。數(shù)據(jù)代表平均值土s.e.m。*p〈〇.〇5,K0對(duì)比WT。（B) 將肝組織從HFD喂養(yǎng)的WT和Nrg4K0小鼠切下并且被處理用于qPCR和免疫印跡法分析。 使用所指出的抗體的總肝裂解物的免疫印跡（頂部）；pSREBPl表示前體蛋白。使用肝細(xì)胞 核提取物的核SREBPl(nSREBPl)的免疫印跡（底部）。核纖層蛋白A/C免疫印跡作為上樣 對(duì)照被包括。
[0063] 圖20 :在原代肝細(xì)胞中，Nrg4通過(guò)LXR激活來(lái)減弱對(duì)脂肪生成基因表達(dá)的誘導(dǎo)。 在含有SEAP或SEAP-Nrg4N62的條件培養(yǎng)基存在下，用媒介物或T0901317處理的原代肝細(xì) 胞中的基因表達(dá)的qPCR分析。數(shù)據(jù)代表平均值土標(biāo)準(zhǔn)差。\〈0. 05。
[0064] 圖21 :脂肪組織中Nrg4的轉(zhuǎn)基因表達(dá)使小鼠免受飲食誘導(dǎo)的肥胖癥。㈧在12 周的HFD喂養(yǎng)之前和之后的WT(實(shí)心柱，n= 10)和aP2-Nrg4轉(zhuǎn)基因（Tg，空心柱，n= 9) 小鼠的生長(zhǎng)曲線。⑶身體組成。（C)在6周的HFD喂養(yǎng)之后的WT和aP2-Nrg4Tg小鼠中 的食物攝取和V02。V02值被標(biāo)準(zhǔn)化為體重（中間圖）和瘦體重（右圖）。
[0065] 圖22:Nrg4轉(zhuǎn)基因小鼠免受HFD誘導(dǎo)的代謝紊亂。㈧在10周的高脂喂養(yǎng)之后 的WT(空心柱，n= 9)和Tg(實(shí)心柱，n= 8)小鼠中的血漿代謝物濃度。⑶在HFD喂養(yǎng) 的WT(空心柱，n= 9)和Tg(實(shí)心柱，n= 8)小鼠中的喂養(yǎng)的和禁食的血糖以及禁食的血 漿胰島素水平。數(shù)據(jù)代表平均值土s.e.m。\〈0.05,WT對(duì)比Tg。
[0066] 圖23 :Nrg4轉(zhuǎn)基因小鼠免受HFD誘導(dǎo)的葡萄糖不耐受性和胰島素抵抗。（A)HFD 喂養(yǎng)的WT(空心，n= 9)和Tg(實(shí)心，n= 8)小鼠中的葡萄糖耐受性測(cè)試。⑶HFD喂養(yǎng) 的WT(空心，n= 9)和Tg(實(shí)心，n= 8)小鼠中的胰島素耐受性測(cè)試。數(shù)據(jù)代表平均值 土s.e.m。*p〈0.05，WT對(duì)比Tg〇
[0067] 圖24:通過(guò)減弱肝脂肪生成使Nrg4轉(zhuǎn)基因小鼠免受HFD誘導(dǎo)的脂肪肝。（A)HFD 喂養(yǎng)的小鼠中的脂肪組織和肝切片的H&E染色。比例尺=100ym。（B)肝TAG含量。（C) 使用總肝裂解物（頂部）和肝細(xì)胞核提取物（底部）的免疫印跡。應(yīng)注意到在來(lái)自Tg小 鼠的肝臟中，前體和核SREBP1的水平減少。（D)自由進(jìn)食的WT(空心）和Tg(實(shí)心）小鼠 中的肝基因表達(dá)的qPCR分析。數(shù)據(jù)代表平均值土s.e.m。*p〈0. 05,WT對(duì)比Tg。
[0068] 圖25:重組Nrg4使飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠中的血糖和胰島素降低。HFD喂養(yǎng)的肥 胖小鼠腹腔內(nèi)注射GST或GST-Nrg4N62每天兩次（每克體重4yg)，持續(xù)共5天。應(yīng)注意到 Nrg4使血糖水平降低，而并非通過(guò)促進(jìn)胰島素分泌。
[0069] 詳述
[0070] 定義
[0071] 如本文所使用，術(shù)語(yǔ)"Nrg4"（SEQIDN0:1)是指由人NRG4基因編碼的蛋白質(zhì)。 Nrg4基于它的序列與其它NRG成員具有同源性而被發(fā)現(xiàn)并且被預(yù)測(cè)編碼115個(gè)氨基酸的前 體蛋白。Nrg4在小鼠和人之間是高度保守的，在EGF樣結(jié)構(gòu)域中具有超過(guò)90%的氨基酸序 列同一性（大約AA1-52,圖1)。因此，在一些實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)"Nrg4"是指SEQIDN0:2， 即由小鼠NRG4基因編碼的蛋白質(zhì)。
[0072] 如本文所使用，術(shù)語(yǔ)"治療的"或"治療"是指如本文所描述的向有需要的患者施 用治療有效量的Nrg4、Nrg4變體或其生物學(xué)活性片段以達(dá)到疾病或病狀的改變或改善的 目的。在某些方面的治療需要以定期間隔施用單劑量或多劑量以改變病狀的過(guò)程。
[0073] 如本文所使用，"施用"意指將藥劑提供給動(dòng)物（包括人類患者），并且包括但不限 于通過(guò)醫(yī)學(xué)專業(yè)人員施用或自我施用。
[0074] 如本文所使用，術(shù)語(yǔ)"共同施用"是指兩種或更多種藥劑向動(dòng)物（包括人類患者） 的施用。在某些方面中，藥劑為單一藥物組合物或分開的藥物組合物。共同施用包括通過(guò) 相同或不同施用路徑施用每種藥劑。共同施用還涵蓋并行或依序施用。
[0075] 如本文所使用，術(shù)語(yǔ)"治療有效量"是指向動(dòng)物（包括人類患者）提供治療益處的 藥劑的量。
[0076] 如文中所使用，"藥學(xué)可接受載體"包括任何和所有的溶劑、分散介質(zhì)、包衣劑、表 面活性劑、抗氧化劑、防腐劑（例如抗菌劑、抗真菌劑）、等滲劑、吸收延遲劑、鹽、防腐劑、藥 物、藥物穩(wěn)定劑、凝膠、粘合劑、賦形劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑、甜味劑、調(diào)味劑、染料等、類似物質(zhì) 和其組合，如本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所知的（Remington's, 1990)。
[0077] 如本文所使用，術(shù)語(yǔ)"代謝紊亂"是指以代謝功能的改變或擾亂為特征的病狀。"代 謝的"和"代謝"是本領(lǐng)域中熟知的術(shù)語(yǔ)并且通常包括發(fā)生在活有機(jī)體內(nèi)的整個(gè)范圍的生物 化學(xué)過(guò)程。
[0078] 本發(fā)明的Nrg4變體可包括天然氨基酸在特定的殘基處的保守性替代。享有共同 的側(cè)鏈性質(zhì)并且適合用于產(chǎn)生保守性替代的氨基酸殘基被如下分組。
[0079] (1)疏水性：正亮氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸；
[0080] (2)中性親水性：半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸；
[0081] (3)酸性：天冬氨酸、谷氨酸；
[0082] (4)堿性：天冬酰胺、谷氨酰胺、組氨酸、賴氨酸、精氨酸；
[0083] (5)影響鏈定向的殘基：甘氨酸、脯氨酸；以及
[0084] (6)芳族：色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸。
[0085] Nrg4
[0086] 本文發(fā)現(xiàn)神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白4(Nrg4)(信號(hào)傳導(dǎo)配體的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白家族的成員）為 調(diào)節(jié)血漿葡萄糖和脂質(zhì)水平以及NAFLD發(fā)展的新型脂肪源性激素。Nrg4表達(dá)在脂肪組織中 是高度富集的并且在褐色和白色脂肪細(xì)胞的分化過(guò)程中被誘導(dǎo)。使用結(jié)合測(cè)定，發(fā)現(xiàn)Nrg4 通過(guò)推定的受體（或多個(gè)受體）以可飽和方式僅僅與肝細(xì)胞結(jié)合。在飲食誘導(dǎo)的和遺傳的 小鼠肥胖癥模型中脂肪細(xì)胞中的Nrg4表達(dá)水平明顯減少，表明了Nrg4不足可促成肥胖癥 相關(guān)聯(lián)的代謝素亂的發(fā)展。對(duì)這一點(diǎn)的支持，在尚脂食物喂養(yǎng)之后Nrg4缺失小鼠患有更嚴(yán) 重的高血糖癥、高血脂癥和肝脂肪變性。相反，Nrg4的脂肪-特異性轉(zhuǎn)基因表達(dá)使血糖和 脂質(zhì)降低，并且減少肝脂肪含量。本文所描述的研究將Nrg4確定為在維持代謝穩(wěn)態(tài)中起有 益作用的新型脂肪源性激素。因此，Nrg4的治療靶向?yàn)橹委熇?型糖尿病、高血脂癥和 NAFLD提供了新途徑。
[0087] 本文所提供的方法包括那些其中待施用的Nrg4為Nrg4變體，該Nrg4變體與SEQ IDN0:1至少45 %相同、至少50 %相同、至少55 %相同、至少60 %相同、至少65 %相同、至少 70%相同、至少75%相同、至少80%相同、至少85%相同、至少90%相同、至少95%相同、至 少96 %相同、至少97 %相同、至少98 %相同、或至少99 %相同。
[0088] 本發(fā)明的Nrg4變體可包括天然氨基酸在特定的殘基處的保守性替代。享有共同 的側(cè)鏈性質(zhì)并且適合用于產(chǎn)生保守性替代的氨基酸殘基被如下分組。
[0089] ⑴疏水性：正亮氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸；
[0090] (2)中性親水性：半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸；
[0091] (3)酸性：天冬氨酸、谷氨酸；
[0092] (4)堿性：天冬酰胺、谷氨酰胺、組氨酸、賴氨酸、精氨酸；
[0093] (5)影響鏈定向的殘基：甘氨酸、脯氨酸；以及
[0094] (6)芳族：色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸。
[0095] 本公開也設(shè)想了包括施用一種或多種Nrg4的生理活性片段以治療以Nrg4的不足 水平或活性為特征的病狀的方法。Nrg4片段包括但不限于缺乏SEQIDNO: 1的前4個(gè)殘 基的Nrg4片段、包括SEQIDN0:1的氨基酸殘基5至46、5至55、5至62、1至46、1至55、 1至52、1至53、4至52、4至53或1至62或者由其組成的片段。本領(lǐng)域中的技術(shù)人員可 通過(guò)在相關(guān)的生物測(cè)定中針對(duì)活性進(jìn)行篩選而容易地篩選活性片段。在各種實(shí)施方案中， Nrg4片段包括x至y的氨基酸殘基或由其組成，其中x為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、 38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、或55，并且7為26、27、28、29、 30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、 55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、 104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、或 115〇
[0096] 在所提供的方法中使用的Nrg4、Nrg4變體或其生物學(xué)活性片段來(lái)源于本領(lǐng)域中 所已知的任何方法。例如，在一個(gè)方面中，Nrg4來(lái)源于表達(dá)內(nèi)源性的Nrg4的細(xì)胞?；蛘?， Nrg4、其變體或生物學(xué)活性片段的來(lái)源來(lái)自于用編碼Nrg4或其前體的核酸載體轉(zhuǎn)化的細(xì) 胞，并且在各種方面中所述細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、整個(gè)有機(jī) 體或其它有用的重組蛋白來(lái)源的細(xì)胞。
[0097] Nrg4的N-端片段（Nrg4的氨基酸1至大約氨基酸52)含有EGF樣結(jié)構(gòu)域并且能 夠與肝細(xì)胞上的它的受體結(jié)合。合成肽或從哺乳動(dòng)物細(xì)胞（例如，中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢CH0)產(chǎn)生 和純化的重組Nrg4可用于降低血糖水平。用Nrg4慢性治療可降低肝脂肪含量，類似于由 轉(zhuǎn)基因Nrg4表達(dá)引起的作用。合成的肽可用N-端乙?；-端酰胺化、?；?、糖基化和聚 乙二醇化以及其它來(lái)修飾以進(jìn)一步改善藥代動(dòng)力學(xué)特征。此外，可使用保留Nrg4的生物活 性的更小肽。
[0098] 對(duì)于Nrg4蛋白的重組產(chǎn)生，提供了編碼重組Nrg4蛋白和控制指導(dǎo)細(xì)菌、哺乳動(dòng)物 或昆蟲細(xì)胞中的蛋白質(zhì)表達(dá)的序列的分離的DNA和/或重組載體。在一些情況下，希望重 組Nrg4編碼序列與可（但不限于）促進(jìn)重組蛋白純化的另外的氨基酸序列融合。例如，在 一個(gè)方面中，所表達(dá)的Nrg4蛋白被表達(dá)為融合蛋白，該融合蛋白包括一個(gè)或多個(gè)組氨酸標(biāo) 記、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（GST)序列、麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP)序列、標(biāo)志序列（Flagsequence) 和/或myc標(biāo)記的RGT序列。這些幫助重組蛋白的純化的另外的序列任選地通過(guò)蛋白酶裂 解來(lái)移除。
[0099] 能夠調(diào)節(jié)Nrg4活件或表汰的化合物
[0100] 也設(shè)想調(diào)節(jié)Nrg4表達(dá)的化合物（即Nrg4調(diào)節(jié)劑）在本公開的范圍內(nèi)。因?yàn)樵诜?胖癥中Nrg4表達(dá)被嚴(yán)重抑制，可能恢復(fù)脂肪細(xì)胞中的Nrg4表達(dá)的化合物或治療可用于產(chǎn) 生治療益處。本文證明了Nrg4表達(dá)被炎癥信號(hào)如TNFa抑制。因此，恢復(fù)脂肪細(xì)胞中的 Nrg4水平的抗炎化合物被認(rèn)為在本公開的范圍內(nèi)。
[0101] 也設(shè)想調(diào)節(jié)Nrg4脫落/激活的化合物（即Nrg4調(diào)節(jié)劑）在本公開的范圍內(nèi)。Nrg4 被合成為前體跨膜蛋白，該前體跨膜蛋白經(jīng)受蛋白水解裂解和脫落或者Nrg4可溶的細(xì)胞 外結(jié)構(gòu)域從膜結(jié)合蛋白的釋放?？扇艿腘rg4釋放到組織中并且循環(huán)對(duì)激活Nrg4是重要 的。裂解Nrg4的確切蛋白酶的身份仍未知。盡管這個(gè)不確定，但是為了并用于實(shí)現(xiàn)與施用 的Nrg4具有類似的代謝益處可篩選出激活脫落事件并且增加活性Nrg4的釋放的化合物。
[0102] 也設(shè)想調(diào)節(jié)Nrg4更新的化合物（即Nrg4調(diào)節(jié)劑）在本公開的范圍內(nèi)。許多激素 在循環(huán)中經(jīng)受快速更新。阻止Nrg4的蛋白水解降解的化合物可增加Nrg4在血漿中的濃度， 并且實(shí)現(xiàn)代謝益處。
[0103] 也設(shè)想調(diào)節(jié)Nrg4受體結(jié)合和信號(hào)傳導(dǎo)的化合物（即Nrg4調(diào)節(jié)劑）在本公開的范 圍內(nèi)。改善Nrg4與其受體結(jié)合并且增加下游信號(hào)傳導(dǎo)事件的另外的化合物可用于延長(zhǎng)和 /或增強(qiáng)靶細(xì)胞中的Nrg4作用。
[0104]通過(guò)施用Nrg4而治療的病狀
[0105] 所提供方法被利用用于治療可通過(guò)施用Nrg4、Nrg4變體或其生物學(xué)活性片段而 減輕的任何病狀。在所提供方法的一些方面中，病狀為代謝紊亂。示例性代謝紊亂包括但 不限于2型糖尿病、高血糖癥、高胰島素血