小檗堿作為金屬β-內酰胺酶抑制劑的新用圖
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及小檗堿的一種新用途，作為金屬β -內酰胺酶抑制劑，用于防止對金 屬β -內酰胺酶敏感的化合物被酶解，優(yōu)選防止金屬β -內酰胺酶對β -內酰胺類抗生素 的水解，對該類抗生素起到保護作用。通過在青霉素等β-內酰胺類抗生素的各類制劑中 添加小檗堿，以抑制產金屬β -內酰胺酶的微生物對β -內酰胺類抗生素的水解，從而提高 β-內酰胺類抗生素的穩(wěn)定性，維持抗生素的療效?；蛘咦鳛轭A防用藥，在使用β-內酰胺 類抗生素之前，先用小檗堿抑制金屬β -內酰胺酶的活性，提高β -內酰胺類抗生素的作用 效果。
【背景技術】
[0002] 內酰胺類抗生素療效好而毒性小，是目前治療感染性疾病的重要藥物。該類 藥物包括青霉素類、頭孢菌素類、青霉烯類、頭霉素類、硫霉素類、單環(huán)內酰胺類抗生素 等，它們結構上都具有一個發(fā)揮抗菌活性不可缺少的內酰胺環(huán)。
[0003] β -內酰胺酶是細菌產生的一類耐藥酶，它可催化β -內酰胺類抗生素中的內酰 胺環(huán)水解開環(huán)而破壞，從而使細菌對β-內酰胺類抗生素產生耐藥性?；贒NA序列相似 性，β -內酰胺酶分為4類：A-D。其中，A，C，D三類酶依賴于活性中心的Ser發(fā)揮催化作用， 可以被克拉維酸、他唑巴坦和舒巴坦等臨床上使用的抗生素所抑制；而B類酶需要依賴活 性中心的Zn發(fā)揮催化作用酶，被稱為金屬β-內酰胺酶（MBL)，該類酶臨床上尚無有效的抑 制劑。
[0004] 2010年8月11日出版的英國《柳葉刀-傳染病》期刊報道了一種新的超級細菌， 該菌能產生NDM-1型金屬β -內酰胺酶（新德里金屬β -內酰胺酶1)，攜帶這一耐藥因子 的新型細菌對幾乎包括碳氫霉烯在內的幾乎所有抗生素都具有抗藥性，患者死亡率很高。 由于這一耐藥因子的基因是存在質粒上的，可以獨立于染色體之外自主復制，并可以轉移 到不同種屬的細菌內，病菌擁有傳播和變異的驚人潛能。NDM-1超級細菌的出現(xiàn)引起全球的 關注和緊張，世界衛(wèi)生組織呼吁各國加強監(jiān)控，敦促各國采取措施抗擊耐藥性細菌，積極 減少細菌對抗生素產生抗藥的機會。NDM-1的出現(xiàn)也使得金屬β -內酰胺酶及其抑制劑的 研究成為全球關注的熱點。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明公開了小檗堿的新用途，其可以抑制金屬內酰胺酶的活性，可作為金 屬β -內酰胺酶抑制劑用于提高β -內酰胺類抗生素的穩(wěn)定性，延長作用時間，提高抗生素 的活性。
[0006] 本發(fā)明具體技術方案如下： 小檗堿及其鹽、水合物或溶劑合物在制備金屬內酰胺酶抑制劑中的用途。
[0007] 小檗堿化合物原型結構如下：
[0008] 本發(fā)明所述的小檗堿可以為季銨式、醛式或醇式的小檗堿。優(yōu)選季銨式的小檗堿。 所述小檗堿的鹽優(yōu)選鹽酸小檗堿或硫酸小檗堿。
[0009] 小檗堿來源簡單，原材料是常見中藥，可以從植物中提取，也可以從原料商業(yè)來源 購買得到。
[0010] 本發(fā)明所述金屬β -內酰胺酶包括IMP-1、V頂-2或NDM-1型金屬β -內酰胺酶。 所述金屬內酰胺酶包括從自然界中提取或用基因工程菌制備的金屬內酰胺酶。
[0011] 本發(fā)明所述的用途，可以將小檗堿及其鹽、水合物或溶劑合物作為金屬β-內酰 胺酶抑制劑，抑制β -內酰胺類抗生素被金屬β -內酰胺酶水解。所述β -內酰胺類抗生素 為分子結構中包括β-內酰胺環(huán)的抗生素。優(yōu)選的，包括青霉素類、頭孢菌素類、青霉烯類、 頭霉素類、硫霉素類、單環(huán)β-內酰胺類抗生素。進一步優(yōu)選，青霉素類的氨芐西林，阿莫西 林，替卡西林，哌拉西林；頭孢類的頭孢氨芐、頭孢拉定，頭孢呋辛，頭孢克洛，頭孢他啶；頭 霉素；單環(huán)β -內酰胺類的氨曲南，碳氫霉烯類的亞胺培南，美羅培南，比阿培南等。
[0012] 本發(fā)明公開了小檗堿作為金屬β -內酰胺酶抑制劑方面的應用，小檗堿可以通過 固體粉末、顆粒以及溶液等形式與β -內酰胺類抗生素混合，以保護抗生素不被金屬β -內 酰胺酶水解，提高內酰胺類抗生素的穩(wěn)定性。或者作為預防用藥，在使用內酰胺類 抗生素之前，先用小檗堿抑制金屬β -內酰胺酶的活性，提高β -內酰胺類抗生素的作用效 果。
[0013] 小檗堿是一種異喹啉生物堿，又稱黃連素，存在于小檗科等4科10屬的許多植物 中。小檗堿對溶血性鏈球菌、金黃色葡萄球菌、淋球菌和弗氏、志賀氏痢疾桿菌均有抗菌作 用，并有增強白血球吞噬作用。小檗堿的鹽酸鹽（俗稱鹽酸黃連素）多用于治療胃腸炎、細 菌性痢疾等，對肺結核、猩紅熱、急性扁桃腺炎和呼吸道感染也有一定療效。隨著臨床耐藥 菌、超級細菌的出現(xiàn)，很多抗生素的臨床效果并不理想，甚至是毫無作用。目前尚未有小檗 堿在抗耐藥菌，尤其是超級細菌作用方面有新的報道，也未見鹽酸小檗堿作為MBL抑制劑， 尤其是對超級細菌產生的NDM-1型金屬β-內酰胺酶的抑制活性方面的報道，本發(fā)明公開 了鹽酸小檗堿這一新的活性，可用于抑制產MBL微生物對β -內酰胺類抗生素的水解，提高 抗生素的穩(wěn)定性，作為β-內酰胺類抗生素的保護劑以及抗超級細菌的潛在藥物，而具有 良好的開發(fā)應用前景。
【具體實施方式】
[0014] 結合以下具體實施例，對本發(fā)明作進一步的詳細說明，本發(fā)明的保護內容不局限 于以下實施例。在不背離發(fā)明構思的精神和范圍下，本領域技術人員能夠想到的變化和優(yōu) 點都被包括在本發(fā)明中，并且以所附的權利要求書為保護范圍。
[0015] 實施例1小檗堿對金屬β -內酰胺酶抑制活性的檢測 使用60 μ Μ頭孢呋辛鈉為底物，所用緩沖液為50mM HEPES (4-羥乙基哌嗪乙磺酸）， 200mM NaCl，100yM ZnCl2，pH = 7. 2,反應溫度為30°C，使用的金屬β-內酰胺酶終濃度為 1〇ηΜ，檢測波長為260nm,具體過程如下： 1. 首先將金屬β -內酰胺酶用緩沖液配置成濃度1〇ηΜ的溶液，置于30°C孵育lOmin， 使得Zn2+充分占據(jù)活性中心； 2. 將小檗堿溶于緩沖液中，配置成不同的濃度，加入到酶液中，30°C孵育6min，使抑制 劑與酶充分結合； 3. 取lml上述溶液加入石英比色皿中，加入3 μ L頭孢呋辛鈉（終濃度60 μ M)搖勻，立 即測定體系吸光度的變化，記錄數(shù)據(jù)。
[0016] 由于底物頭孢呋辛鈉被酶水解后其吸光度下降，因而通過測定吸光度的變化可以 表征底物的水解程度。計算不同濃度的小檗堿對β-內酰胺酶水解底物的抑制率，以化合 物的濃度對抑制率擬合曲線，計算IC5。值，并以已知的NDM-1酶抑制劑L-卡托普利作為陽 性對照，結果表明小檗堿抑制NDM-1型金屬β -內酰胺酶的IC5。為6. 77±0. 45 μΜ，抑制 V頂-2型金屬β -內酰胺酶的1(：5。為12. 21±1. 30 μΜ，抑制頂Ρ-