1型金屬β -內(nèi)酰胺酶的 IC5。為 10. 12±0· 57μΜ(表 1)。
[0017] 表1對金屬β -內(nèi)酰胺酶的抑制活性（μ mol/L)
*注ND:未檢測 實施例2鹽酸小檗堿對β-內(nèi)酰胺類抗生素的保護作用 試驗所用的產(chǎn)MBLs菌株為基因工程菌E. coli BL21 (DE3)/pET28a-NDM-l菌，該菌株 可以胞內(nèi)可溶性表達(dá)NDM-1型β -內(nèi)酰胺酶，水解β -內(nèi)酰胺類抗生素，使抗生素失活。以 E.coli BL21(DE3)/pET28a菌株作為陰性對照。采用二倍稀釋法測定，通過保護指數(shù)反映小 檗堿對抗生素的保護作用。
[0018] 保護指數(shù)定義為，達(dá)到相同活性效果（如抑菌）時，未添加保護劑時抗生素所使用 的濃度，與添加保護劑時抗生素所用濃度的比值，如下式：該值大于1時，表明加入保護劑 后，抗生素需要使用的量可減少，該值越大，表明保護劑的效果越強。
具體方法如下： 將超低溫冰箱中保存的工程菌菌株E. coli BL21 (DE3) /pET28a-NDM-l (產(chǎn)酶菌）以及 對照菌株E. coli BL21 (DE3)/pET28a(對照菌）分別接種于滅菌的Luria-Bertani (LB)固 體培養(yǎng)基中，于37°C恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12小時。用接種環(huán)挑取單菌落分別轉(zhuǎn)接到滅菌 的液體LB培養(yǎng)基中，于37 °C，200rpm條件下震蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期。用紫外分光光度計測 定600nm波長處菌液的吸光度值（0D_)，根據(jù)10D = 1 X 109CFU/mL的換算關(guān)系，分別將表 達(dá)金屬β -內(nèi)酰胺酶的工程菌菌株以及對照菌株用無菌LB培養(yǎng)基稀釋至1 X 106CFU/mL，加 入到無菌96孔板中，分別測定單獨使用抗生素、抗生素+小檗堿對細(xì)菌的抑制能力，測定小 檗堿對抗生素的保護指數(shù)。
[0020] (1)鹽酸小檗堿對頭孢呋辛鈉的保護作用 精密稱取鹽酸小檗堿32mg，加入滅菌的蒸餾水10mL，加熱溶解作為儲備液。將抗生素 頭孢呋辛鈉用無菌生理鹽水（〇. 9 % NaCl)溶解配置成512 μ g/mL溶液，取100 μ 1加入到 96孔板的第1列孔中，然后從該孔中取50 μ 1轉(zhuǎn)入第2列孔中，加入無菌生理鹽水50 μ 1， 用移液槍小心吹吸幾次混勻，再取50 μ 1轉(zhuǎn)入第3列孔中，同法加入無菌生理鹽水進行二倍 比稀釋。然后在各孔中分別加入50 μ 1菌液，使抗生素終濃度為256~1 μ g/mL。試驗組分 別加入1 μ 1鹽酸小檗堿儲備液，對應(yīng)鹽酸小檗堿終濃度為32 μ g/mL ;對照組加入1 μ 1無 菌蒸餾水。以上各組于37°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12-16小時，觀察各孔細(xì)菌的生長情況，結(jié)果如 表2所示，其中" + "代表菌生長，"一"代表菌不生長： 表2.鹽酸小檗堿對頭孢呋辛鈉的保護指數(shù)測定結(jié)果
從表2結(jié)果可得，單獨使用頭孢呋辛鈉對產(chǎn)NDM-1型金屬β-內(nèi)酰胺酶的E. coli菌MIC 為128 μ g/mL，加入鹽酸小檗堿后，頭孢呋辛鈉對該產(chǎn)酶菌的MIC為16 μ g/mL ;相對應(yīng)不含 頭孢呋辛鈉，僅加入32 μ g/mL鹽酸小檗堿的對照組中，耐藥菌正常生長，表明在該濃度下， 單獨使用鹽酸小檗堿對產(chǎn)酶菌的生長沒有抑制作用，鹽酸小檗堿是通過抑制NDM-1對頭孢 呋辛鈉的水解，從而增強了頭孢呋辛鈉的抗產(chǎn)酶菌活性。計算得到鹽酸小檗堿對頭孢呋辛 鈉的保護指數(shù)為8。
[0021] (2)硫酸小檗堿對美羅培南的保護作用 精密稱取硫酸小檗堿24mg，加入滅菌的蒸餾水10mL，加熱溶解作為儲備液。將抗生素 美羅培南用無菌生理鹽水（〇. 9 % NaCl)溶解配置成512 μ g/mL溶液，取100 μ 1加入到96 孔板的第1列孔中，然后從該孔中取50 μ 1轉(zhuǎn)入第2列孔中，加入無菌生理鹽水50 μ 1，用移 液槍小心吹吸幾次混勻，再取50 μ 1轉(zhuǎn)入第3列孔中，同法加入無菌生理鹽水進行二倍比稀 釋。然后在各孔中分別加入50 μ 1菌液，使抗生素終濃度為256~1 μ g/mL。試驗組分別加 入1 μ 1硫酸小檗堿儲備液，對應(yīng)硫酸小檗堿終濃度為24 μ g/mL ;對照組加入1 μ 1無菌蒸 餾水。以上各組于37°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12-16小時，觀察各孔細(xì)菌的生長情況，結(jié)果如表1 所示，其中" + "代表菌生長，"一"代表菌不生長（表3)。
[0022] 表3.硫酸小檗堿對美羅培南的保護指數(shù)測定結(jié)果
從表3結(jié)果可得，單獨使用美羅培南對產(chǎn)NDM-1型金屬β -內(nèi)酰胺酶的E. coli菌MIC 為64 μ g/mL，加入硫酸小檗堿后，美羅培南對該產(chǎn)酶菌的MIC為16 μ g/mL ;相對應(yīng)不含美羅 培南，僅加入24 μ g/mL硫酸小檗堿的對照組中，耐藥菌正常生長，表明在該濃度下，單獨使 用硫酸小檗堿對產(chǎn)酶菌的生長沒有抑制作用，硫酸小檗堿是通過抑制NDM-1對美羅培南的 水解，從而增強了美羅培南的抗產(chǎn)酶菌活性。計算得到硫酸小檗堿對美羅培南的保護指數(shù) 為4〇
【主權(quán)項】
1. 小檗堿及其鹽、水合物或溶劑合物在制備金屬-內(nèi)酰胺酶抑制劑中的用途。2. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述小檗堿為季銨式、醛式或醇式的小檗堿。3. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述小檗堿的鹽為鹽酸小檗堿或硫酸小檗 堿。4. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述金屬-內(nèi)酰胺酶包括IMP-UVIM-2或 NDM-I型金屬-內(nèi)酰胺酶。5. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述金屬P _內(nèi)酰胺酶包括從自然界中提取 或用基因工程菌制備的金屬(6-內(nèi)酰胺酶。6. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于將小檗堿及其鹽、水合物或溶劑合物作為金 屬P -內(nèi)酰胺酶抑制劑，抑制(6 -內(nèi)酰胺類抗生素被金屬(6 -內(nèi)酰胺酶水解。7. 如權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于所述0 -內(nèi)酰胺類抗生素為分子結(jié)構(gòu)中包括 0-內(nèi)酰胺環(huán)的抗生素。8. 如權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于所述P -內(nèi)酰胺類抗生素包括青霉素類、頭孢 菌素類、青霉烯類、頭霉素類、硫霉素類、單環(huán)(6-內(nèi)酰胺類抗生素。
【專利摘要】本發(fā)明公開了小檗堿的一種新用途，可作為金屬β-內(nèi)酰胺酶抑制劑用于防止對金屬β-內(nèi)酰胺酶敏感的化合物被酶解，特別是防止金屬β-內(nèi)酰胺酶對β-內(nèi)酰胺類抗生素的水解，對該類抗生素起到保護作用。
【IPC分類】A61K31/407, A61K31/4375, A61K31/43, A61K31/431, A61P31/04, A61K31/546
【公開號】CN105232548
【申請?zhí)枴緾N201510765820
【發(fā)明人】鄭珩, 勞興珍, 周丹丹, 余永柱
【申請人】南京廣方生物科技有限公司
【公開日】2016年1月13日
【申請日】2015年11月11日