凝膠成像系統(tǒng)軟件進行分析。結果表明：正常對照組、糖 尿病模型組、長非編碼核糖核酸N0NRATT021972小干擾RNA處理組、小干擾RNA陰性對照 組以及二甲雙胍灌胃組的GKmRNA的平均光密度值之間的表達存在顯著差異（F(4, 10) =11. 45,p< 0· 01)。分別是 0· 54±0· 06、0· 38±0· 04、0· 50±0· 03、0· 40±0· 01、 0. 63±0. 06(η= 3)。與對照組相比，糖尿病模型組大鼠肝臟中GKmRNA的表達量明顯降 低，統(tǒng)計學分析有顯著差異（P< 0. 01)，糖尿病模型+小干擾RNA陰性對照組GKmRNA表 達量也明顯降低，有統(tǒng)計學差異（P< 0.05);與糖尿病模型組相比，長非編碼核糖核酸 N0NRATT021972小干擾處理組和二甲雙胍灌胃組大鼠肝臟中GKmRNA的表達明顯升高，有 顯著差異性（F(2, 6) = 15. 27,p< 0.01);糖尿病模型組及糖尿病模型+小干擾RNA陰性 對照組之間則無統(tǒng)計學差異（P> 0. 05)(見圖3)。
[0164] 5. 2蛋白印跡結果：
[0165] 用Image-Tool軟件分析圖像，讀取各組目的條帶以及β-actin條帶的綜合光 密度值，然后用目的條帶比β-actin條帶的綜合光密度值即可得到GK蛋白的相對表 達量。結果顯示：正常對照組、糖尿病模型組、長非編碼核糖核酸N0NRATT021972小干 擾RNA處理組、小干擾RNA陰性對照組以及二甲雙胍灌胃組的GK蛋白表達量存在顯著 性差異（F(4, 10) = 146. 85,p< 0· 01)。分別是 0· 62±0· 04、0· 47±0· 03、0· 93±0· 05、 0. 50±0. 05、1. 49±0. 07(n= 3)。與Ctrl+NS組相比，DM+NS組和DM+NCsi組大鼠肝臟GK 蛋白表達量明顯降低（F(2, 6) = 6. 51，p< 0. 01);與DM+NS組相比，DM+長非編碼核糖核 酸N0NRATT021972si組和DM+Met組的GK蛋白表達量則顯著增加（F(2,6) = 202. 66,p< 0. 01) ;DM+NS組與DM+NCsi組的GK蛋白表達量則無統(tǒng)計學差異（p> 0. 05)(見圖4)。
[0166](六）大鼠糖原變化。
[0167] 正常對照組、糖尿病模型組、長非編碼核糖核酸N0NRATT021972小干擾處理組、小 干擾RNA陰性對照組以及二甲雙胍灌胃組的糖原含量存在顯著差異（F(4,35)= 408.89，p< 0. 01)。DM+NS組、DM+NCsi組與Ctrl組相比，糖元含量明顯降低，有顯著差異性（Ffe21) = 678. 25,p< 0. 01) ;DM+Met組、DM+長非編碼核糖核酸N0NRATT021972 小干擾RNA(si)組 與DM+NS組相比，糖原含量明顯增加，有顯著差異性（F(2,21)= 115. 12,p< 0. 01) ;DM+Met組與DM+NCsi組相比無統(tǒng)計學差異（p>0. 05)(見表5)。
[0168] 表5. 2型糖尿病大鼠肝糖原變化
[0169]
[0170] 各組大鼠樣本數(shù)各8只，實驗數(shù)據(jù)用???表示。其中*p〈0. 05,wp〈0. 01表示和正 常組比較；#P〈〇. 05, ##p〈0. 01表示和模型組比較。
[0171](七）培養(yǎng)大鼠肝細胞（BRL-3A)細胞株實驗結果。
[0172] 7. 1大鼠肝細胞（BRL-3A)細胞株GKmRNA表達變化。
[0173]RT-PCR結果采用凝膠成像系統(tǒng)軟件進行分析，結果表明：Ctrl組、HGHF組、 HGHF+長非編碼核糖核酸N0NRATT021972小干擾核糖核酸（siRNA)組、HGHF+NCsi組和 HGHF+Vector組的GKmRNA的平均光密度值之間的表達存在顯著差異（Fai(])= 20.6,p< 0· 01)。分別是 0· 28±0· 01、0· 20±0· 03、0· 31±0· 01、0· 20±01、0· 23±0· 01。與Ctrl組相 比，HGHF組、HGHF+NCsi組、HGHF+Vector組肝細胞中GKmRNA的表達明顯降低，有顯著差 異性（Fae=l〇. 39，p< 0. 01) ;HGHF+長非編碼核糖核酸N0NRATT021972siRNA組與HGHF 組、HGHF+NCsi組、HGHF+Vector組比較，HGHF+ 長非編碼核糖核酸N0NRATT021972siRNA組 肝細胞中GKmRNA的表達明顯升高，且有顯著差異性（Ffts)= 21. 33,p< 0. 01)，HGHF組、 HGHF+NCsi組和HGHF+Vector組之間無統(tǒng)計學差異（F(2i6)= 1. 96,p>0. 05)(見圖 5)。
[0174] 7. 2.大鼠肝細胞（BRL-3A)細胞株GK蛋白表達變化。
[0175]Western結果采用凝膠成像系統(tǒng)軟件進行分析，結果表明：Ctrl組、HGHF組、 HGHF+長非編碼核糖核酸N0NRATT021972小干擾核糖核酸（siRNA)組、HGHF+NCsi組和 HGHF+Vector組的GK蛋白平均表達量存在顯著性差異（Fam= 12. 91，p< 0.01)，分 別是 1. 24±0· 18、0· 78±0· 07、1· 35±0· 01、0· 98±0· 08、0· 96±0· 01。與Ctrl組相比， HGHF+Vector組、HGHF+NCsi組肝細胞中GK的表達降低（F0,s)= 4. 49,p<0· 05)，HGHF組 肝細胞中GK的表達明顯降低（p< 0. 01) ;HGHF+長非編碼核糖核酸N0NRATT021972siRNA 組較HGHF組肝細胞中GK的表達顯著升高（p< 0. 01)，HGHF組、HGHF+NCsi組、HGHF+Vector 組之間無統(tǒng)計學差異（Ffe6) = 1. 20,p>0. 05)(見圖6)。
[0176](八）2型糖尿病人血清中長非編碼核糖核酸N0NRATT021972的濃度變化。
[0177] 逆轉錄聚合酶鏈式反應方法檢測觀察到2型糖尿病人血清中長非編碼核糖核酸 N0NRATT021972的濃度較健康對照組增加（p〈0. 05)(見圖7)。
[0178] 發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)長非編碼核糖核酸N0NRATT021972小干擾核糖核酸可降低2型糖 尿病模型大鼠升高的血糖、血清炎性因子水平、氧化應激水平、升高抗氧化物質(zhì)的活性、提 高血胰島素水平、增加肝糖原水平，其機理涉及增加葡萄糖激酶（GK)表達、提高葡萄糖激 酶（GK)活性。2型糖尿病人血清中長非編碼核糖核酸N0NRATT021972的濃度增加，提示其 可能成為糖尿病及其并發(fā)病、高血脂引發(fā)疾病、N0NRATT021972功能異常疾病、葡萄糖激酶 (GK)介導疾病的診斷標志物。本發(fā)明為防治糖尿病并發(fā)疾病探明新方法，這將有助于長非 編碼核糖核酸N0NRATT021972小干擾核糖核酸所涉及糖尿病并發(fā)疾病及其它相關疾病的 藥物防治應用。
【主權項】
1. 長非編碼核糖核酸N0NRATT021972小干擾核糖核酸在制備治療降低高血糖治療糖 尿病及其并發(fā)疾病的防治藥物中的應用。2. 長非編碼核糖核酸N0NRATT021972小干擾核糖核酸在制備治療在制備降血脂防治 尚血脂引發(fā)相關疾病的藥物中的應用。3. 長非編碼核糖核酸N0NRATT021972小干擾核糖核酸在制備治療肝葡萄糖激酶（GK) 功能異常引發(fā)糖尿病、代謝病及相關并發(fā)疾病的防治藥物中的應用。4. 長非編碼核糖核酸N0NRATT021972小干擾核糖核酸在制備治療肝組織長非編碼核 糖核酸N0NRATT021972功能異常相關疾病的防治藥物中的應用。5. 長非編碼核糖核酸N0NRATT021972在制備糖尿病及其并發(fā)疾病或長非編碼核糖核 酸N0NRATT021972功能異常相關疾病的診斷試劑、探針或診斷標志物等的應用。6. 長非編碼核糖核酸N0NRATT021972小干擾核糖核酸以口服、注射、含片或其它局部 或全身用藥劑型藥物進行上述疾病的診斷、預防和治療。
【專利摘要】長非編碼核糖核酸NONRATT021972小干擾RNA在制備糖尿病及并發(fā)疾病藥物中的應用，NONRATT021972小干擾核糖核酸可降低2型糖尿病模型大鼠血糖、血清炎性因子水平、升高抗氧化物質(zhì)的活性、提高血胰島素水平、增加肝糖原水平，提高葡萄糖激酶(GK)活性。本發(fā)明還可在制備降血脂防治高血脂引發(fā)相關疾病、肝葡萄糖激酶(GK)功能異常引發(fā)糖尿病、代謝病及相關并發(fā)疾病、肝組織長非編碼核糖核酸NONRATT021972功能異常相關疾病藥物中的應用。可以口服、注射、含片或其它局部或全身可用藥劑型藥物進行相關疾病的診斷、預防和治療。
【IPC分類】A61P1/16, A61P3/10, A61K31/713, C12Q1/68, A61K48/00, A61P3/06
【公開號】CN105251015
【申請?zhí)枴緾N201510504742
【發(fā)明人】梁尚棟, 宋渺渺, 彭力超, 吳炳, 李桂林, 劉雙梅, 徐宏, 吳紅, 張春平
【申請人】南昌大學
【公開日】2016年1月20日
【申請日】2015年8月17日