Nonratt021972小干擾rna在制備神經(jīng)組織其功能異常及相關(guān)疾病藥物中應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及制備治療神經(jīng)組織長(zhǎng)非編碼核糖核酸N0NRATT021972功能異常及相 關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著基因組測(cè)序計(jì)劃的完成以及新一代深度測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用，人們發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物 細(xì)胞中多于95%的轉(zhuǎn)錄序列為非編碼核糖核酸（noncodingRNA，ncRNA)。非編碼RNA是一 類不編碼蛋白質(zhì)但具有生物學(xué)調(diào)控功能的RNA分子，它可通過參與mRNA的穩(wěn)定和翻譯水平 的調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)的運(yùn)輸、RNA的加工和修飾以及影響染色體的結(jié)構(gòu)等機(jī)制，調(diào)控生物體的基 本生命活動(dòng)，同時(shí)與一些重要疾病的病理生理過程相關(guān)。非編碼RNA包括短非編碼核糖核 酸（包括siRNA、miRNA、piRNA)和長(zhǎng)非編碼核糖核酸（longnon-codingRNA,IncRNA)。長(zhǎng) 度大于200個(gè)堿基（200nt)為長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)。目前長(zhǎng)度小于50個(gè)核苷酸的非編 碼RNA(如microRNA、siRNA和piRNA)等的研究已取得突破性進(jìn)展，但對(duì)具有功能的長(zhǎng)非編 碼RNA的研究不多。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于提供長(zhǎng)非編碼核糖核酸N0NRATT021972小干擾RNA的新用 途，長(zhǎng)非編碼核糖核酸N0NRATT021972小干擾RNA在制備神經(jīng)組織長(zhǎng)非編碼核糖核酸 N0NRATT021972功能異常及相關(guān)疾病藥物中的應(yīng)用。
[0004] 本發(fā)明用SOLiD高通量測(cè)序并通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和分子生物學(xué)驗(yàn)證確定大鼠 背根神經(jīng)節(jié)（DRG)存在長(zhǎng)非編碼核糖核酸N0NRATT021972[http://www·noncode·org]，并 發(fā)現(xiàn)糖尿病模型大鼠背根神經(jīng)節(jié)長(zhǎng)非編碼核糖核酸N0NRATT021972表達(dá)較對(duì)照組明顯增 加，提示背根神經(jīng)節(jié)的長(zhǎng)非編碼核糖核酸N0NRATT021972與神經(jīng)功能與病理變化有關(guān)。
[0005] 本發(fā)明通過觀察長(zhǎng)非編碼核糖核酸N0NRATT021972小干擾RNA處理后2型糖尿病 大鼠神經(jīng)功能的改善，為長(zhǎng)非編碼核糖核酸N0NRATT021972小干擾RNA在制備神經(jīng)組織長(zhǎng) 非編碼核糖核酸N0NRATT021972功能異常及并發(fā)疾病的的診斷、預(yù)防和治療提供幫助。
[0006] 在注射長(zhǎng)非編碼核糖核酸N0NRATT021972的小干擾核糖核酸后，2型糖尿病模 型組DRG中長(zhǎng)非編碼核糖核酸N0NRATT021972的表達(dá)降低，同時(shí)在注射干擾試劑后糖尿 病大鼠的機(jī)械痛和熱敏痛閾值升高，且尾神經(jīng)感覺傳導(dǎo)速度增加，表明長(zhǎng)非編碼核糖核酸 N0NRATT021972小干擾RNA可對(duì)神經(jīng)組織長(zhǎng)非編碼核糖核酸N0NRATT021972功能異常及 并發(fā)疾病產(chǎn)生作用，改善神經(jīng)的損傷現(xiàn)象。長(zhǎng)非編碼核糖核酸N0NRATT021972的小干擾核 糖核酸處理后同時(shí)可下調(diào)降低糖尿病大鼠血清中細(xì)胞炎性因子一腫瘤壞死因子（TNF-α) 的含量，增加糖尿病大鼠血清中過氧化氫酶（CAT)和超氧化物歧化酶（SOD)的活性。因 此，長(zhǎng)非編碼核糖核酸N0NRATT021972小干擾RNA具有對(duì)神經(jīng)組織長(zhǎng)非編碼核糖核酸 N0NRATT021972功能異常及相關(guān)疾病的改善作用。
【附圖說明】
[0007]圖1為2型糖尿病大鼠制模過程中的機(jī)械縮足反射閾值變化圖。長(zhǎng)非編碼核糖核 酸N0NRATT021972的小干擾RNA處理后對(duì)2型糖尿病大鼠的機(jī)械痛行為具有抑制作用。實(shí) 驗(yàn)分組：對(duì)照組；2型糖尿病模型組；2型糖尿病模型+長(zhǎng)非編碼核糖核酸N0NRATT021972的 小干擾RNA處理組；2型糖尿病模型+亂序的小干擾RNA陰性（NCsi)對(duì)照組。其中\(zhòng)〈0.05， wp〈0. 01表示和正常組比較，##p〈0. 01表示與糖尿病模型組比較。
[0008]圖2為2型糖尿病大鼠制模過程中的熱縮足反射閾值變化圖。長(zhǎng)非編碼核糖核酸 N0NRATT021972的小干擾RNA處理后對(duì)2型糖尿病大鼠的熱敏痛行為具有抑制作用。其中 實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組；2型糖尿病模型組；2型糖尿病模型+長(zhǎng)非編碼核糖核酸N0NRATT021972 的小干擾RNA處理組；2型糖尿病模型+亂序的小干擾RNA陰性對(duì)照組。其中\(zhòng)〈0.05， wp〈0. 01表示和正常組比較，##p〈0. 01表示與糖尿病模型組比較。
[0009]圖3為2型糖尿病大鼠制模過程中的尾神經(jīng)感覺傳導(dǎo)速度變化圖。長(zhǎng)非編碼核糖 核酸N0NRATT021972的小干擾RNA處理后可改善2型糖尿病大鼠的尾神經(jīng)感覺傳導(dǎo)速度。 實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組；2型糖尿病模型組；2型糖尿病模型+長(zhǎng)非編碼核糖核酸N0NRATT021972 的小干擾RNA處理組；2型糖尿病模型+亂序的小干擾RNA陰性對(duì)照組。其中\(zhòng)〈0.05， wp〈0. 01表示和正常組比較，##p〈0. 01表示與糖尿病模型組比較。
[0010] 圖4為2型糖尿病大鼠背根神經(jīng)節(jié)（DRG)長(zhǎng)非編碼核糖核酸N0NRATT021972的逆 轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR)檢測(cè)結(jié)果圖。長(zhǎng)非編碼核糖核酸N0NRATT021972的小干擾 RNA處理后可降低2型糖尿病大鼠DRG上調(diào)的長(zhǎng)非編碼核糖核酸N0NRATT021972水平。實(shí) 驗(yàn)分組：對(duì)照組；2型糖尿病模型組；2型糖尿病模型+長(zhǎng)非編碼核糖核酸N0NRATT021972的 小干擾RNA處理組；2型糖尿病模型+亂序的小干擾RNA陰性對(duì)照組。圖4 (a)為RT-PCR實(shí) 驗(yàn)結(jié)果圖，圖4(b)為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析比較柱狀圖，其中#p〈0. 01表示和正常組比較，##p〈0. 01 表示與糖尿病模型組比較。
[0011] 圖5為2型糖尿病大鼠血清TNF-α變化檢測(cè)結(jié)果圖。長(zhǎng)非編碼核糖核酸 N0NRATT021972的小干擾RNA處理后可降低2型糖尿病大鼠上調(diào)的血清TNF- a變化水平。 實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組；2型糖尿病模型組；2型糖尿病模型+長(zhǎng)非編碼核糖核酸N0NRATT021972 的小干擾RNA處理組；2型糖尿病模型+亂序的小干擾RNA陰性對(duì)照組。其中wp〈0. 01表 示和正常組比較，##p〈0. 01表示與糖尿病模型組比較。
[0012] 圖6為2型糖尿病大鼠血清過氧化氫酶活性測(cè)定結(jié)果圖。長(zhǎng)非編碼核糖核酸 N0NRATT021972的小干擾RNA處理后可增加2型糖尿病大鼠下調(diào)的血清過氧化氫酶（CAT) 活性水平。實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組；2型糖尿病模型組；2型糖尿病模型+長(zhǎng)非編碼核糖核酸 N0NRATT021972的小干擾RNA處理組；2型糖尿病模型+亂序的小干擾RNA陰性對(duì)照組。其 中#p〈0. 01表示和正常組比較，##p〈0. 01表示與糖尿病模型組比較。
[0013]圖7為2型糖尿病大鼠血清超氧化物歧化酶活性測(cè)定結(jié)果圖。長(zhǎng)非編碼核糖核酸 N0NRATT021972的小干擾RNA處理后可升增加2型糖尿病大鼠下調(diào)的血清超氧化物歧化酶 (S0D)活性水平。實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組；2型糖尿病模型組；2型糖尿病模型+長(zhǎng)非編碼核糖核 酸N0NRATT021972的小干擾RNA處理組；2型糖尿病模型+亂序的小干擾RNA陰性對(duì)照組。 其中#p〈0. 01表示和正常組比較，##p〈0. 01表示與糖尿病模型組比較。
【具體實(shí)施方式】
[0014] 下面結(jié)合實(shí)施例并對(duì)照附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0015] 實(shí)施例1。
[0016] 用本技術(shù)領(lǐng)域公知的方法，制成適用于制備神經(jīng)組織長(zhǎng)非編碼核糖核酸 N0NRATT021972功能異常及并發(fā)疾病的診斷、預(yù)防、治療的口服、注射、含片或其它局部或全 身用藥劑型的含長(zhǎng)非編碼核糖核酸N0NRATT021972小干擾RNA制劑。
[0017] -、材料和方法。
[0018] 1.動(dòng)物和分組。
[0019] 健康Sprague-DaWley(SD)大鼠，南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供。健康SD 雄性大鼠60只，體重200g左右，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分成2組，對(duì)照組（Ctrl)8只，喂 以基礎(chǔ)飼料；其余大鼠（52只）為糖尿病造模組，喂以高糖高脂飼料（高糖高脂飼料配方： 基礎(chǔ)飼料66. 5%，蔗糖20%，豬油10%，膽固醇2. 5%，膽酸鈉1 %，做成球狀放在恒溫鼓風(fēng) 干燥箱中80°C干烤2天）。第5周末，所有大鼠測(cè)體重、空腹血糖和餐后血糖后，造模組大 鼠空腹腹腔注射STZ30mg/kg(STZ溶液的配制：臨用前將STZ溶解于4°C冰箱預(yù)冷的pH為 4. 2的0.lmol/L檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液中，配制成2. 5g/L的STZ溶液），對(duì)照組大鼠腹腔 注射相同體積的〇.lmol/L，pH為4. 2檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液。第6周末測(cè)血糖，空腹血 糖<7. 8mmol/L且餐后血糖< 11.lmmol/L的造模組大鼠再次給予空腹腹腔注射STZ30mg/ kg。第7周末測(cè)血糖，空腹血糖大于7. 8mmol/L，或餐后血糖> 11.lmmol/L為成模標(biāo)準(zhǔn)。
[0020] 長(zhǎng)非編碼核糖核酸N0NRATT021972小RNA干擾（siRNA)序列由 Invitrogen(Carlsbad,CA)公司提供，靶序列為 5' -GAATGTTGGTCATATCAAA-3'；陰性對(duì) 照scrambledsiRNA(CNsi)購至Invitrogen(Carlsbad,CA)公司。在體轉(zhuǎn)染試劑由 Entranster?公司提供。根據(jù)Entranster?在體轉(zhuǎn)染說明書，實(shí)驗(yàn)第7周末對(duì)糖尿病造模 成功的大鼠進(jìn)行長(zhǎng)非編碼核糖核酸N0NRATT021972-siRNA在體小干擾實(shí)驗(yàn)。
[0021] 在第7周末將糖尿病造模成模的大鼠隨機(jī)分成3組，S卩：糖尿病模型+生理鹽水 組（DM+NS)，糖尿病模型+長(zhǎng)非編碼核糖核酸N0NRATT021972小干擾核糖核酸（s